Programul de afiliere a celulelor și a biologiei moleculare, Universitatea din New York Langone Medical Center, New York, New York, Statele Unite ale Americii, Centrul de cercetare a demenței, Institutul Nathan Kline, Orangeburg, New York, Statele Unite ale Americii

suprimă

Centrul de tehnologie a genomului de afiliere, Universitatea din New York Centrul medical Langone, New York, New York, Statele Unite ale Americii

Centrul de Afilieri pentru Cercetarea Dementei, Institutul Nathan Kline, Orangeburg, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Psihiatrie, Universitatea din New York Centrul Medical Langone, New York, New York, Statele Unite ale Americii

Afilieri Genome Technology Center, New York University Langone Medical Center, New York, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de patologie, New York University Langone Medical Center, New York, New York, Statele Unite ale Americii

Program de afiliere a celulelor și a biologiei moleculare, Universitatea din New York Langone Medical Center, New York, New York, Statele Unite ale Americii, Centrul pentru Cercetări Dementa, Institutul Nathan Kline, Orangeburg, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Psihiatrie, New York Universitatea Langone Medical Center, New York, New York, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Neuroștiințe și Fiziologie, Universitatea din New York Langone Medical Center, New York, New York, Statele Unite ale Americii

  • Marissa J. Schafer,
  • Igor Dolgalev,
  • Melissa J. Alldred,
  • Adriana Heguy,
  • Stephen D. Ginsberg

Cifre

Abstract

Citare: Schafer MJ, Dolgalev I, Alldred MJ, Heguy A, Ginsberg SD (2015) Restricția caloriilor suprimă semnăturile transcripționale ale hipocampului dependente de vârstă. PLoS ONE 10 (7): e0133923. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0133923

Editor: Rosalyn M. Anderson, Universitatea din Wisconsin, STATELE UNITE

Primit: 18 martie 2015; Admis: 2 iulie 2015; Publicat: 29 iulie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=ghitaeuqddoltyl&acc=GSE69952.

Finanțarea: Această cercetare a fost susținută de granturile Institutelor Naționale de Sănătate AG043375, AG014449, AG017617, GM007238, RR029893, TR000038 și Asociația Alzheimer (IIRG-12-237253).

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Conexiunile sinaptice disfuncționale și neurodegenerarea sunt considerate a fi originile celulare ale memoriei dependente de vârstă și ale tulburărilor cognitive [1]. Formarea hipocampului, în special sectorul hipocampic CA1, este un centru central de învățare și memorie în creierul mamiferelor care prezintă plasticitate sinaptică dependentă de activitate în formarea rețelei neuronale [2]. Neuronii piramidali CA1 sunt sever afectați în AD, în timp ce alte câteva tipuri de lob temporal și celule hipocampice sunt relativ scutite pe parcursul progresului patologiei. Compilarea proceselor celulare responsabile de această vulnerabilitate selectivă nu sunt pe deplin înțelese [3,4].

Regiunea hipocampală este predispusă la agregarea anormală a proteinelor, sugerând o disfuncție a controlului calității proteomei pe tot parcursul îmbătrânirii [1]. În timpul îmbătrânirii normale a hipocampului, caracterizat prin hrănire ad libitum (AL) și fără patologie evidentă, deficitele de memorie spațială coincid cu reglarea descendentă a genelor implicate în răspunsul proteic desfășurat, inclusiv șocul termic 70 kDa proteină 5 (Hspa5) și calreticulină (Calr) [5] ], precum și reglarea negativă a genelor de plasticitate sinaptică [6]. Caracteristicile electrice și structurale intrinseci ale neuronilor piramidali CA1 pot contribui, de asemenea, la vulnerabilitatea neurodegenerativă, unde susceptibilitatea la excitotoxicitate poate proveni din capacitatea redusă de tamponare a calciului la vârste mai înaintate, în raport cu tipurile de celule mai puțin excitabile [7,8]. Mai mult, neuronii piramidali CA1 sunt dependenți de semnalizarea factorului trofic pro-supraviețuire, incluzând factorul neurotrofic derivat din creier (Bdnf) și reducerea semnalizării factorului trofic pe tot parcursul îmbătrânirii, care apare coincident cu pierderea neuronilor și afectarea memoriei, poate contribui, de asemenea, la fenotip de vulnerabilitate [9,10].

Materiale și metode

Modelul mouse-ului și accesiunea țesuturilor

Protocoalele animale pentru acest studiu au fost în acord cu ghidurile NIH și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Institutului Nathan Kline și Centrul Medical Langone din NYU. Un subset de șoareci aplicați acestor experimente au fost folosiți ca șoareci martor într-un studiu publicat recent [16]. La vârsta de aproximativ 2,5 luni, șoarecii de sex feminin Swiss Webster x DBA/C57BL6 F1 au fost repartizați aleatoriu în regimuri dietetice AL sau 30% CR (reducere specifică carbohidraților) (AL, # D12450B; 30% CR, # D03020702B; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ). Șoarecii CR au fost hrăniți cu repartizarea zilnică dimineața, iar dietele CR au fost ajustate săptămânal, în funcție de aportul zilnic mediu al grupului AL. Greutățile corporale au fost măsurate de două ori pe săptămână. La vârsta de aproximativ 5 sau 15 luni, după 2,5 sau 12,5 luni de administrare a dietei, șoarecilor li s-a administrat o doză letală de ketamină (80 mg/kg) și xilazină (13 mg/kg), perfuzată transcardic cu gheață 0,1 Tampon fosfat M și creierele au fost îndepărtate rapid. Jertfele au avut loc la mijlocul după-amiezii. Regiunea CA1 a hipocampului a fost microdisecată din plăcile de țesut folosind un microscop de disecție, înghețată pe gheață uscată și stocată la -80 ° C, așa cum s-a descris anterior [27].

Izolarea ARN, pregătirea bibliotecii și secvențierea

ARN-ul a fost izolat din microdisecții congelate hipocampice CA1 folosind miRNAeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA) conform specificațiilor producătorului. Bioanaliza (2100, Agilent Biotechnologies, Santa Clara, CA) a fost utilizată pentru a determina concentrația și calitatea ARN-ului. 300 ng de ARN total cu o valoare medie a numărului de integritate a ARN (RIN) de 9 a fost aplicat trusei de preparare a probei ARN TruSeq v2 (Illumina, San Diego, CA) pentru a construi biblioteci de secvențiere a ARNm. Calitatea bibliotecilor a fost evaluată utilizând bioanaliza Agilent, iar cuantificarea a fost efectuată prin qPCR. Bibliotecile au fost aplicate la 8 runde de secvențiere a perechilor de 50 de baze pe o platformă HiSeq 2500 (Illumina), folosind modul de rulare rapidă. Cinci și șase replici biologice au fost secvențiate pe condiții de dietă pentru grupuri de 5 și respectiv 15 luni.

Analiza statistică și adnotarea funcțională a expresiei genelor

Apelarea de bază a fost efectuată utilizând software-ul Illumina bcl2fastq. Citirile secvențiale au fost aliniate la genomul mouse-ului (UCSC build mm10) folosind alinierea TopHat conștientă de splice. Probabil că duplicatele PCR au fost eliminate cu instrumentul Picard MarkDuplicates. Citirile cartografiate filtrate au fost analizate folosind pachetul Butoni cu parametrii impliciti și următoarele adăugiri. A fost aplicată o corecție a prejudecății fragmentelor pentru a îmbunătăți acuratețea estimărilor abundenței transcrierilor și a fost aplicată o corecție cu citire multiplă pentru cartarea citirilor în greutate la mai multe locații din genom. Metoda de estimare a dispersiei utilizată a fost combinarea implicită, în care fiecare condiție replicată a fost modelată și calculată în medie pentru a furniza un singur model global pentru toate condițiile. Genele exprimate diferențial au fost determinate pe baza valorii p ajustate cu rata de descoperire falsă (FDR) Fig 1. Greutatea corporală medie după hrănirea susținută cu 30% CR sau AL.

Începând cu aproximativ 2,5 luni, șoarecii femele de tip sălbatic au fost menținuți pe 30% CR (purpuriu) sau AL (albastru) diete și au fost sacrificați după 2,5 sau 12,5 luni de administrare a dietei. Greutatea corporală a fost măsurată aproximativ de două ori pe săptămână. În primele 2 săptămâni de hrănire AL și CR, șoarecii menținuți pe dieta CR 30% au pierdut în medie 12% din greutatea corporală (testul t, p Fig 2. Varianța biologică în cadrul grupurilor de condiții de secvențiere a ARNm.

Coeficientul de variație pătrat (CV 2) a fost reprezentat în funcție de Fragmente pe kilobază de exon per milion de fragmente cartografiate (log10FPKM), reprezentând distribuția totală a citirii secvenței mRNA pentru fiecare grup de condiții, care sunt descrise după cum urmează, 5 luni AL (coral), 5 luni CR (verde), 15 luni AL (albastru) și 15 luni CR (violet).

Comparația profilurilor de expresie CA1 de la șoareci de 15 luni cu cei de șoareci de 5 luni menținuți pe dieta AL control au identificat 2.610 transcrieri reglementate diferențial într-un interval de schimbare log2 ori de -4,98 la 6,98 (p Fig 3. Expresia diferențială a genei prin secvența ARNm analize comparații în perechi.

Numărul total de transcrieri exprimate diferențial identificate prin secvențierea ARNm total în fiecare comparație pereche sunt indicate, împreună cu intervalul de schimbare log2 fold (Log2FC) și numărul de ținte reglate în sus (gri) și reglate în jos (alb) (p Fig 4. Long- termenul CR se opune funcțiilor celulare dependente de vârstă și inversează expresia genelor dependente de vârstă în sectorul CA1 al hipocampului.

(A) IPA comparativ a fost folosit pentru a prezice funcțiile opuse activate (scor z ≥ 2) sau inactivate (scor z ≥ -2) în cadrul AL, 15 vs. 5 luni și 15 luni, CR vs. Seturi de date AL. (B) 882 din modificările genei 887 comune la îmbătrânirea normală (AL, 15 vs. 5 luni) și dieta CR în seturile de date CA1 în vârstă (15 luni CR vs. AL) apar în direcția opusă. (C) Reprezentarea netedă a densității modificărilor normale de îmbătrânire (AL 15 luni/AL 5 luni) comparativ cu dieta CR în modificările CA1 în vârstă (CR 15 luni/AL 15 luni) pentru 887 gene comune ambelor seturi de date, ilustrând inversarea CR a modificări dependente de vârstă. (D) descrierea Heatmap a 882 modificări ale expresiei dependente de vârstă suprimate de CR, comparând valorile medii ale modificării log2 ori pentru fiecare genă (p Tabelul 1. Căi canonice asociate funcțional cu semnătura expresiei suprimate CR în CA1 hipocampic-adult.

(p Fig 5. Reglarea crescută a semnelor genelor neuroprotectoare se păstrează la 5 și 15 luni, în ciuda profilelor transcripționale divergente.