• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de Steven A. Farber, Carnegie Institution for Science, Baltimore, MD și acceptat de Comitetul Editorial 26 ianuarie 2016 (primit pentru revizuire 9 iulie 2015)

glucozei

Semnificaţie

Hormonul leptină menține homeostatic depozitele de grăsimi pe termen lung la mamifere. Realizat de adipocite proporțional cu masa totală adipoasă, funcția leptinei prin reglarea circuitelor comportamentale, autonome și endocrine din SNC pentru a controla consumul și cheltuielile de energie. Deoarece leptina semnalează suficiența nutrițională, acționează și ca factor de reducere a maturării și competenței reproducerii. Semnalizarea defectuoasă a leptinei la mamifere duce la hiperfagie, obezitate, diabet și infertilitate. Se știe mult mai puțin despre leptină la vertebratele non-mamifere; cu toate acestea, omologul leptinei teleost nu este exprimat în principal în adipocite. Aici arătăm că leptina peștilor zebră nu este necesară pentru adipostază, consumul de alimente sau reproducere. Cu toate acestea, arătăm aici că, la fel ca la mamifere, leptina peștilor zebră își păstrează un rol în reglarea homeostaziei glucozei.

Abstract

Hormonul leptină a fost identificat la adipocitele mamiferelor (1) și bine caracterizat la șoareci și oameni ca hormon adipostatic. Este secretat în ser proporțional cu masa adiposă și reglează homeostatic masa adiposă în principal prin legarea la un receptor distinct de leptină exprimat în circuite de control comportamentale, endocrine și autonome din sistemul nervos central (2, 3). Eșecul semnalizării leptinei, din cauza mutațiilor genelor receptorilor de leptină sau leptină, are ca rezultat hiperfagia și hipometabolismul pentru a produce obezitate extremă, diabet și infertilitate. Leptina și receptorul de leptină sunt foarte conservate la speciile de mamifere. Proteinele de șoarece și leptină umană sunt 83% identice, iar proteinele receptorilor de leptină sunt 75% identice. Cu toate acestea, secvențele de aminoacizi ale leptinei și receptorilor de leptină la mamifere sunt mai puțin bine conservate cu cele ale vertebratelor inferioare. Într-adevăr, utilizarea omologiei secvenței primare nu a reușit să identifice gena leptinei la pești sau păsări; sintenia cromozomială a fost utilizată în cele din urmă pentru a identifica gena din aceste clase de vertebrate (4). De exemplu, proteina leptină pește zebră este doar 19% identică cu proteina umană.

Rezultate

Mutația receptorului de leptină la peștele zebră adult are un efect limitat asupra dimensiunii corpului, greutății, adipozității și hrănirii.

Genomul peștelui zebră conține o genă a receptorului de leptină (lepră) (11) și două gene de leptină, lepa și lepb (12). Pentru a studia sistemul de leptină în teleoste, am obținut o linie de pește zebră care exprimă o formă mutantă a receptorului de leptină (13). Alela sa1508, obținută prin screening pentru mutații după mutageneza N-etil-N-nitrozourea (ENU), este o mutație fără sens care duce la un codon oprit prematur după începerea domeniului citoplasmatic al receptorului (Fig. S1A ). Această mutantă este comparabilă cu izoforma receptorului de leptină trunchiată fără semnalizare la șoarecii db/db (14) și păstrăvul curcubeu (15).

Alinierea proteinelor pentru mutațiile prezise. (A) Indicați cu caractere aldine pe secvența de lepră de șoarece sunt aminoacizii citoplasmatici 13-24 și 31-36, care s-au dovedit a fi esențiali pentru recrutarea și activarea Jak2. Înconjurați de o cutie sunt aminoacizii care cuprind domeniul transmembranar și motivul Box1. (B) Alinierea alelelor lepa mutante WT și lepa lepa testate pentru numărul de celule β. Am identificat două alele la pești F1 heterozigoți care au dus la codoni identici de oprire timpurie între helix A și B de lepa. Codonii Stop sunt indicați cu un asterisc; aminoacizii C-terminali rămași sunt indicați la sfârșitul secvenței. AA, aminoacizi; DaRe, Danio rerio; MuMu, Mus musculus; OnMy, Oncorhynchus mykiss.

Mutația receptorului de leptină la peștele zebră nu are niciun efect asupra fertilității.

Un fenotip suplimentar al deficitului de leptină la șoareci și oameni este infertilitatea (17, 18). Prin urmare, am investigat competența reproductivă prin încrucișarea fraților de tip sălbatic, precum și a adulților mutanți lepr sa1508/sa1508 și marcând productivitatea și eficiența evenimentelor de reproducere (Fig. 2). Productivitatea reproductivă a fost determinată prin numărarea dimensiunilor individuale ale ambreiajului a cinci perechi din fiecare genotip cu perioade variabile de separare (reproducere zilnică, 3-4 zile, 6 zile sau ≥ 8 zile de separare). Mărimea ambreiajului crește în funcție de momentul separării părinților, dar nu s-a observat niciun efect al genotipului asupra numărului de ouă fertilizate depuse (Fig. 2A) sau frecvența reproducerii cu succes (Fig. 2B).

Fecunditatea și eficiența împerecherii în peștele zebră mutant normal și în receptorul leptinei. (A) Ouă fertilizate din cupluri mutante WT și lepră sa1508/sa1508 adaptate vârstei crescute zilnic sau cu perioade variabile de separare între reproducere, cu zile de separare indicate. ANOVA bidirecțional arată un efect semnificativ pentru zile de separare [F (3, 71) = 13,29, P 0,05] sau o interacțiune a celor două [F (1, 71) = 0,29, P> 0,05]. (B) Eficiența împerecherii pentru împerecherea mutantă WT și lepră sa1508/sa1508 pentru pești cu vârsta de 3-6 luni. Datele afișate ca medii ± SEM (P> 0,05, testul exact al lui Fisher); indicat numărul de încercări de împerechere.

Mutația receptorului de leptină în expresia genetică a insulinei și a glucagonului crescută a peștilor zebri larvali și a masei celulare.

Șoarecii cu diabet zaharat cu deficit de receptor de leptină (db/db) prezintă hiperglicemie la vârsta de 3-4 săptămâni (19). Nivelurile de ARNm hepatic pentru leptină s-au dovedit a se schimba la post în zebră, crap comun, somon atlantic și arctic (5), iar leptina recombinantă s-a dovedit a induce mobilizarea hepatică a glucozei în tilapie (20). Astfel, am urmărit în continuare să examinăm efectele deficienței receptorului de leptină asupra homeostaziei glucozei din peștele zebră (Fig. 3).

Mutația receptorului de leptină în peștele zebră modifică expresia generației implicată în metabolizarea glucozei hepatice.

Apoi, am investigat nivelurile de transcriere ale enzimelor cheie în metabolismul hepatic al glucozei la 6 dpf (Fig. 3J). Folosind qPCR, am găsit o reglare în sus a fosfenolpiruvatului carboxichinazei mitocondriale, dar nu citosolice (pck2 și respectiv pck1) la lepr sa1508/sa1508 alevin mutant. Am testat pentru transcrieri specifice ficatului de glicogen fosforilază (pygl) și piruvat kinază (pklr) și am constatat că primele sunt reglementate în sus în lepr sa1508/sa1508 mutant alevin. În cele din urmă, ne-am uitat la fosfataza glucozei 6 (g6ca.1) și a izoformelor transportoare de glucoză (glut) exprimate în ficatul zebră (2, 5, 8 și 9a; ref. 27). Am găsit o reglare semnificativă a g6pase, slc2a2 și slc2a5 la lepr sa1508/sa1508 mutant alevin, dar nu slc2a8 sau slc2a9l1 (Fig. 3J). Am expus larvele la metformină, un medicament despre care se crede că are efecte benefice la pacienții cu diabet zaharat din cauza efectelor asupra homeostaziei hepatice la glucoză și a sensibilității la insulină (28). Expunerea larvelor la metformină de la 3 la 5 dpf a abolit complet creșterea observată la lepr sa1508/sa1508 alevin mutant la 5 dpf (Fig. 3K).

Mutația receptorului de leptină la peștele zebră adult duce la modificarea toleranței la glucoză și la exprimarea genei hepatice.

Pentru a confirma că aceste fenotipuri de insule au rezultat din semnalizarea defectă a leptinei, am folosit mutageneză CRISPR la embrioni de pește zebră și am caracterizat puii rezultați la o vârstă comparabilă după mutageneză a genelor de lepră, lepă sau lepb într-o linie de pește zebră care poartă un marker de celule β. Datele anterioare arată că această metodă poate fi utilizată pentru a caracteriza relațiile genotip - fenotip în generația F0, deoarece mutageneza bialelelică cu randamente de până la 80% poate fi realizată cu ușurință (26). Am constatat că mutageneza leprei și a leprei, dar nu și a lepbului, a prezentat un număr crescut de celule β. De asemenea, am replicat o creștere a numărului de celule β în larvele frate mutante F2 mutante pentru lepa, oferind un sprijin independent al validității utilizării CRISPR în generația F0 și rolul leprei și lepei în fenotipul insulei. Aceste date susțin ipoteza că semnalizarea leptinei reglează masa celulei β în peștele zebra larval.

De asemenea, s-a constatat că genele implicate în metabolismul glucozei în ficat sunt nereglementate. Am constatat că ARNm pentru forma mitocondrială (pck2), dar nu citosolică (pck1) a PEPCK este crescut. Deși forma citosolică are un rol mai canonic în gluconeogeneză, mPEPCK hepatică joacă, de asemenea, un rol în gluconeogeneză și reducerea zgomotului genei scade glicemia din șoareci (38). În plus, am văzut o creștere a expresiei hepatice de glicogen fosforilază (glicogenoliză) și nicio modificare a expresiei piruvat kinazei (glicoliză). În plus, am observat o creștere a glucozei 6 fosfatază (g6ca.1) și a transportorilor de glucoză 2 și 5. Luate împreună, aceste rezultate sugerează creșterea gluconeogenezei și glicogenolizei în larve. Cu toate acestea, când ne-am uitat la expresia hepatică a adulților ∼5 h după masă, am găsit modificări ale transcrierilor în glicogen fosforilaza și transportatorii de glucoză 5 și 9a, dar niciunul dintre celelalte transcrieri. Împreună, schimbările de expresie observate susțin o dereglare în căile multiple de homeostazie a glucozei. Interesant este faptul că tratamentul cu metformină a normalizat numărul de celule β din lepr sa1508/sa1508 alevin mutant, oferind un anumit sprijin pentru ideea că semnalizarea redusă a leptinei își exercită efectele prin ficat și/sau alte țesuturi periferice.

Hrănirea bogată în grăsimi din peștele zebră duce la o creștere compensatorie a numărului de celule β (25). Un răspuns similar la semnalizarea defectă a leptinei, prezentat aici, a sugerat că semnalul nutrițional care duce la creșterea numărului de celule β poate necesita leptină. Într-adevăr, animalele de lepră sa1508/sa1508 nu au răspuns nici unei provocări nutritive acute sau susținute prin creșterea numărului de celule β. Acest rezultat sugerează că animalele mutante lepr sa1508/sa1508 nu au o cale de semnalizare critică pentru creșterea compensatorie a masei celulei β ca răspuns la supranutriție. Datele din peștele zebră (30) arată că excesul de nutrienți duce la celulele β să secrete FGF, ceea ce duce apoi la diferențierea celulelor β. Antagonistul receptorului FGF (FGFR) SU5402 blochează, de asemenea, creșterea numărului de celule β din cauza semnalării defectuoase a leptinei. Prin urmare, semnalizarea FGF pare să acționeze în aval de leptină în reglarea masei celulei β.

În concluzie, datele raportate aici (Tabelul 1), în special în contextul expresiei limitate a leptinei în țesutul adipos la pești, susțin ipoteza că leptina nu este un factor adipostatic la pești. Datele arată un efect susținut al deficitului de lepră asupra nivelurilor totale de transcripție a insulinei și glucagonului și a expresiei genice hepatice neregulate la peștii larvați și adulți. Datele din larve arată efecte clare asupra reglării nutriționale și de dezvoltare a numărului de celule β. Au fost necesare studii suplimentare pentru a determina efectele leptinei de pește zebră asupra producției hepatice de glucoză, a acțiunii glucozei și a acțiunii insulinei. Deoarece reglarea componentelor homeostaziei glucozei pare a fi o funcție conservată a leptinei la pești și mamifere, aceste date sugerează că această funcție a fost conservată de-a lungul evoluției vertebratelor și că rolul leptinei în adipostază s-a dezvoltat ulterior la mamifere sau a fost pierdut și înlocuit de o cale de semnalizare încă necunoscută la pești.

Comparația acțiunii leptinei la mamifere și pești zebră larvare