Masami Suzuki, Minoru Narita, Minami Hasegawa, Sadayoshi Furuta, Tomoyuki Kawamata, Maho Ashikawa, Kanako Miyano, Kazuyoshi Yanagihara, Fumiko Chiwaki, Takahiro Ochiya, Tsutomu Suzuki, Motohiro Matoba, Hiroki Sasaki; Senzația de durere abdominală indusă de carcinomatoza peritoneală este însoțită de modificări în expresia receptorilor de substanță P și μ-opioizi din măduva spinării la șoareci. Anestezie 2012; 117: 847-856 doi: https://doi.org/10.1097/ALN.0b013e31826a4ac8

senzația

Descărcați fișierul de citare:

Pacienții cu carcinomatoză peritoneală raportează adesea dureri abdominale, care sunt relativ refractare la morfină. S-a considerat că este necesar un nou model animal pentru investigarea mecanismului durerii abdominale pentru dezvoltarea tratamentelor optime pentru acest tip de durere.

Pentru a pregăti un model de carcinomatoză peritoneală, în cavitatea abdominală au fost implantate celule de cancer gastric cu semințe foarte peritoneale, 60As6. Modalitatea nociceptivă pentru comportamentul legat de durere a fost evaluată în termeni de comportament de sevraj ca răspuns la stimuli mecanici și comportament curbat. Probele de țesut de la ganglionii rădăcinii dorsale ale șoarecilor și măduva spinării au fost supuse imunohistochimiei și reacției în lanț în timp real a transcripției polimerazei.

Șoarecii cu diseminare peritoneală au arătat o hipersensibilitate semnificativă a abdomenului la stimularea mecanică și la un comportament spontan asociat durerii viscerale. A existat o creștere semnificativă a celulelor c-Fos-pozitive în măduva spinării la șoarecii purtători de tumori. Acei șoareci au prezentat o creștere remarcabilă a neuronilor substanței P-pozitivi în ganglionii rădăcinii dorsale (control vs. tumoră, 15,4 ± 1,1 vs. 24,2 ± 3,6, P

Atât reglarea în sus a substanței P, cât și reglarea în jos a receptorului μ-opioid observat în ganglionii rădăcinii dorsale pot fi, cel puțin parțial, responsabili de starea asemănătoare durerii abdominale asociate cu carcinomatoza peritoneală.

Ce știm deja despre acest subiect

Unii pacienți cu cancer au o tumoare răspândită pe tot peritoneul abdominal

Boala tumorilor peritoneale răspândite, carcinomatoza, poate fi dureroasă și refractară la terapiile analgezice convenționale

Ce ne spune acest articol că este nou

Anchetatorii au dezvoltat un model de șoarece de carcinomatoză

Studiile comportamentale arată că răspunsurile legate de durere sunt prezente și, ca și la pacienți, răspunsurile sunt rezistente la morfină

În viitor, pot fi studiate terapiile experimentale ale durerii

Durerea moderată sau severă asociată cu cancerul poate afecta în mod dramatic calitatea vieții și supraviețuirea pacienților și afectează 64% dintre cei cu cancer metastazat sau în stadiu avansat.1 Intensitatea percepută a acestei dureri depinde de tipul specific de cancer și de localizarea acestuia, precum și sensibilitatea fiecărui pacient la durere.2 Durerea asociată cu cancerul este, în general, tratată cu opioide, medicamente antiinflamatoare nesteroidiene, corticosteroizi, anestezice locale, antidepresive și anticonvulsivante, fie singure, fie în combinație. poate fi dificil de controlat durerea la unii pacienți cu cancer terminal. În consecință, sunt necesare tratamente mai eficiente. Înțelegerea noastră slabă a mecanismului durerii asociat cancerelor continuă să stea ca un obstacol major în calea descoperirii de analgezice noi pentru a răspunde acestei nevoi.

Materiale și metode

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările etice ale Asociației Internaționale pentru Studiul Durerii15 și au fost aprobate de Comitetul pentru Etica Experimentării pe Animale din Centrul Național al Cancerului (Tsukiji, Tokyo, Japonia). În cadrul experimentelor, s-au făcut eforturi pentru a reduce la minimum numărul de animale utilizate și suferința lor.

Animale

Au fost folosiți șoareci masculi C.B17/Icr-scid și șoareci Institute of Cancer Research cu o greutate de 22-25 g. Șoarecii au fost cumpărați de la CLEA Japonia (Tokyo, Japonia) și adăpostiți la o temperatură a camerei de 23 ± 1 ° C cu un ciclu de lumină - întuneric de 12 ore. Șoarecii au fost menținuți în condiții specifice fără patogeni și au furnizat hrană sterilă, apă și cuști.

Linii celulare și cultură

O linie celulară de cancer gastric scirros uman, HSC60, a fost stabilită așa cum s-a descris anterior. peretele unui șoarec scid. Pentru șase iterații, am recoltat celule tumorale ascitice și am efectuat inocularea ortotopică a acestor celule în șoareci pentru a stabili o linie celulară 60As6 extrem de metastatică. Această linie celulară a fost menținută în mediu RPMI1640 suplimentat cu ser de vițel fetal (10%), 100 U/ml penicilină G sodiu și 100 μg/ml sulfat de streptomicină sub o atmosferă de 5% dioxid de carbon și 95% aer la 37 ° C. Pentru a stabili transfectanții care au exprimat gena luciferazei, s-au folosit vectori plasmidici purtători ai genei luciferazei licurici, care au fost numiți pLuc/Neo și un reactiv de transfecție, LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), conform recomandărilor producătorului. Geneticina (500 μg/ml; Invitrogen) a fost utilizată pentru a selecta transfectanții stabili, iar clonele transfectate au fost examinate pentru exprimarea genei luciferazei prin detectarea bioluminescenței utilizând un sistem IVIS (Xenogen, Alameda, CA). Clonele care exprimă gena luciferazei au fost denumite celule 60As6Luc.

Inocularea intraperitoneală a celulelor 60As6Luc

Densitatea celulelor 60As6Luc a fost ajustată la 1 × 106 celule per 1 ml soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). În grupul experimental, suspensia celulară a fost injectată în cavitatea abdominală printr-un ac de calibru 26,5 introdus în abdomenul central. În grupul de control, PBS a fost injectat în cavitatea abdominală în loc de celule 60As6Luc.

Măsurarea creșterii tumorale utilizând imagistica cu luciferază

Pentru măsurarea creșterii tumorii, a fost utilizată imagistica cu luciferază a întregului corp cu un sistem de imagistică IVIS pentru a vizualiza celulele 60As6Luc sub un timp de integrare de 10 minute pentru achiziționarea imaginii, așa cum s-a descris anterior.18 Pe scurt, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 15 mg D-luciferină sare de potasiu în 1 ml PBS folosind o seringă de calibru 26,5. Au fost apoi ținute anesteziate cu izofluran. Sarcina relativă a metastazelor tumorale a fost determinată utilizând software-ul Living Image (versiunea 2.50, Xenogen).

Modelul pancreatitei acute

Caeruleina este un analog al colecistochininei care duce la pancreatită acută. Pancreatita acută a fost indusă prin injectarea repetată a șoarecilor cu caeruleină (administrare intraperitoneală; 50 μg/kg; de șase ori la intervale de 1 oră). 19,20 Caeruleina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a fost dizolvată în ser fiziologic.

Modelul durerii inflamatorii

Cu șoarecii anesteziați cu izofluran, suprafața plantară a labei posterioare drepte a fost injectată cu adjuvant Freund complet (CFA; Mycobacterium tuberculosis; Sigma Chemical Co.) într-un volum de 20 μl pentru a crea un model de durere inflamatorie persistentă21.

Test de comportament

Hipersensibilitatea abdomenului la stimularea mecanică a fost cuantificată prin numărarea numărului de comportamente de retragere (retragerea abdomenului departe de un filament von Frey, linsul abdomenului ca urmare a stimulării sau retragerea întregului corp) ca răspuns la aplicarea stimulare mecanică (filamente von Frey cu o forță de îndoire de 0,02 g) către abdomen.19,20 Șoarecii au fost așezați pe o podea din plasă de sârmă mărită și închiși sub cutii de plastic negre răsturnate individual. Filamentele von Frey au fost aplicate prin podeaua ochiurilor în diferite puncte de pe suprafața abdomenului. Fiecare filament a fost aplicat de cinci ori la intervale de 5-10 s și din nou după o perioadă de odihnă de 1 minut, în total de 10 ori. Comportamentul nociceptiv a fost marcat după cum urmează: 0 = fără răspuns; 1 = ușoară încercare imediată de a scăpa sau de a linge ușor sau a zgâria locul stimulat; 2 = retragere intensă a abdomenului sau sărituri. Valorile raportate sunt scorurile totale pentru răspunsurile la 10 provocări. Observatorul nu era conștient de starea experimentală a mouse-ului. Testarea comportamentală a fost efectuată în zilele 14 și 28 după inocularea tumorii.

Comportamentul înțepător a fost examinat așa cum s-a descris anterior, cu unele modificări. Scorul de curbare a fost timpul (timpul) total (e) la care mouse-ul a prezentat un comportament de cocoșare înmulțit cu factorul de scor, care a fost definit în conformitate cu Sevcik și colab. 14: 0 = luciu normal al stratului, prezintă un comportament exploratoriu; 1 = postură ușoară rotunjită, prezintă un comportament exploratoriu ușor redus, luciu normal al stratului; 2 = postură rotunjită severă, prezintă un comportament exploratoriu considerabil redus, piloerecție, contracții abdominale intermitente. Testarea comportamentală a fost efectuată în zilele 14 și 28 după inocularea tumorii. Observatorul nu era conștient de starea experimentală a mouse-ului. Testarea comportamentală a fost efectuată în zilele 14 și 28 după inocularea tumorii.

Imunohistochimie

Reacție în lanț în timp real cu transcripție inversă a polimerazei (RT-PCR)

Tabelul 1. Exemple de secvențe pentru genele șoarecilor caracterizate în acest experiment

Analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD). Toți parametrii statistici utilizați în experimente au fost calculați utilizând GraphPad PRISM (versiunea 5.0a; GraphPad Software, La Jolla, CA). Semnificația statistică a diferențelor dintre grupuri a fost evaluată cu ANOVA unidirecțional, urmată de testul de comparație multiplă Bonferroni sau testul t Student nepereche (cu două cozi). O valoare P de 6 celule/cavitate). Analizele de numărare a fotonilor au fost efectuate la locul diseminării la intervale de 7 zile. Figura 1A prezintă un exemplu tipic. Această metodă a făcut posibilă observarea acelorași animale în timp. O curbă de creștere a tumorii care a reflectat progresia diseminării peritoneale a fost obținută prin reprezentarea numărului de fotoni în funcție de timp (Fig. 1B, n = 5). Diseminarea către mezenter și peritoneul parietal a fost observată pe baza aspectului macroscopic al diseminării peritoneale la șoareci la 28 de zile după inoculare (fig. 1, C și D, vârfuri de săgeți).

FIG. 1. Caracterizarea modelului de metastază peritoneală. Analiza numărării fotonilor a diseminării peritoneale după inocularea intraperitoneală a celulelor Luc 60As6. Șoarecii Scid care au purtat tumori 60As6Luc în cavitatea abdominală au fost anesteziați și supuși observațiilor după administrarea intraperitoneală de luciferină (A). Analiza cantitativă a progresiei metastazei peritoneale diseminate a celulelor tumorale (n = 5). Acest experiment a fost repetat de trei ori și rezultate similare au fost observate de fiecare dată (B). Dovezi macroscopice ale diseminării peritoneale la șoareci scid care poartă celule tumorale. Au existat leziuni metastatice la nivelul intestinului (C, vârfurile săgeții) și peritoneul parietal (D, vârfurile săgeții). Bara de măsurare: 10 mm.

FIG. 1. Caracterizarea modelului de metastază peritoneală. Analiza numărării fotonilor a diseminării peritoneale după inocularea intraperitoneală a celulelor Luc 60As6. Șoarecii Scid care au purtat tumori 60As6Luc în cavitatea abdominală au fost anesteziați și supuși observațiilor după administrarea intraperitoneală de luciferină (A). Analiza cantitativă a progresiei metastazei peritoneale diseminate a celulelor tumorale (n = 5). Acest experiment a fost repetat de trei ori și rezultate similare au fost observate de fiecare dată (B). Dovezi macroscopice ale diseminării peritoneale la șoareci scid care poartă celule tumorale. Au existat leziuni metastatice la nivelul intestinului (C, vârfurile săgeții) și peritoneul parietal (D, vârfurile săgeții). Bara de măsurare: 10 mm.

Hipersensibilitate la stimularea mecanică și comportamentul asociat durerii viscerale induse de carcinomatoza peritoneală la șoareci

Modificări ale celulelor c-Fos-pozitive în cornul dorsal al măduvei spinării induse de carcinomatoza peritoneală

Modificări în expresia substanței P, CGRP și MOR induse de carcinomatoza peritoneală la șoareci

Modificări ale MOR în substanța P-pozitivă neuronii DRG induși de carcinomatoza peritoneală la șoareci

Efectul administrării sistemice a morfinei asupra comportamentului nociceptiv ca răspuns la stimularea mecanică la șoareci purtători de tumori, șoareci injectați cu caeruleină și șoareci injectați cu CFA

Discuţie

Pacienții cu cancer în stadii avansate, în special cei cu metastaze osoase și peritonită canceroasă, suportă dureri semnificative. Pacienții cu tumori care implică distrugerea oaselor și leziuni ale nervilor sunt deosebit de susceptibili de a suferi dureri severe.27, -, 29 Deși sunt disponibile ghiduri publicate pentru gestionarea durerii, utilizarea de rutină a acestui tratament nu ameliorează întotdeauna acest tip de durere.3,29,30 Cancer durerea este adesea tratată de doze mai mari de morfină, care pot fi însoțite de efecte secundare, inclusiv sedare, depresie respiratorie și interferență cu motilitatea gastro-intestinală și adesea oferă doar o ușurare incompletă. Nu este surprinzător că sunt necesare analgezice noi și mai eficiente pentru tratamentul durerii severe de cancer rezistente la opioide, cum ar fi durerea abdominală cauzată de peritonita canceroasă.

În acest studiu, am dezvoltat un nou model de șoarece pentru durerea abdominală cauzată de peritonită canceroasă. În general, este dificil să se monitorizeze creșterea și progresia ulterioară a tumorilor către peritonită canceroasă, spre deosebire de tumorile subcutanate. În studiul actual, am observat progresia diseminării în timp real folosind celule transfectate cu gena luciferază și o analiză in vivo de numărare a fotonilor. Nivelul intensității fotonilor emiși a crescut treptat în timp după inocularea celulelor tumorale, iar nivelul intensității la 28 de zile după inocularea tumorii a fost de aproximativ 10 ori mai mare decât la 7 zile. Șoarecii cu diseminare peritoneală au arătat creșteri dramatice atât a scorurilor lor nociceptive, ca răspuns la stimularea mecanică, cât și la comportamentul asociat durerii viscerale la 28 de zile după inocularea celulelor tumorale. Cu toate acestea, aceste comportamente asemănătoare durerii nu au fost observate la 14 zile după inoculare, sugerând că această hipersensibilitate abdominală este observată predominant la șoareci în stadiul relativ târziu al peritonitei canceroase.

Nociceptorii transmit informații de la periferie la măduva spinării, unde vizează neuronii secundari din straturile superficiale (L1-2 lamine) și profunde (L3-5 lamine) ale coarnelor dorsale.31 Unii dintre acești neuroni secundari sunt neuroni de proiecție care apoi trec această informație nociceptivă către sistemul nervos central.31 Pentru a identifica vizual modificările activității neuronilor spinali legate de durere în acest model, am observat modificările imunoreactivității c-Fos, o genă imediat-timpurie care este utilizată pe scară largă în durere cercetarea ca marker pentru activarea neuronală.32, -, 34 La 28 de zile după inoculare, a existat o creștere a celulelor c-Fos-pozitive atât în ​​straturile superficiale, cât și în cele profunde ale măduvei spinării. Neuronii de ordinul doi din măduva spinării care primesc intrare aferentă viscerală sunt localizați în principal în lamina spinală superficială, mai adânc în lamina L5 și L10. Unele studii au arătat că structurile somatice trimit aferențe la lamina L1-3 și la lamina L4 și L5 profunde. rezultă în progresia durerii de amploare însoțită de o creștere a celulelor c-Fos-pozitive în măduva spinării.

În concluzie, șoarecii cu carcinomatoză peritoneală prezintă hipersensibilitate la stimulare mecanică și comportament asemănător durerii viscerale, care este însoțită de reglarea în sus a substanței P și reglarea în jos a MOR. Acest model nou dezvoltat poate fi important pentru studierea patogeniei durerii abdominale cauzate de peritonita canceroasă.