Abstract

În acest studiu, am folosit o abordare integrată in vivo și ex vivo într-un model murin de obezitate indusă de dietă pentru a explora mecanismele disfuncției endoteliale în obezitate, concentrându-ne pe posibila implicare a iNOS. Raportăm o serie de descoperiri noi: 1) obezitatea se caracterizează prin expresia iNOS în vasculatură; 2) producția vasculară de ROS compensează vasodilatația mediată de acetilcolină; 3) șoarecii lipsiți de iNOS sunt protejați împotriva rezistenței legate de obezitate la efectele de scădere a glucozei și vasodilatatoare ale insulinei, dar au totuși tensiune arterială crescută și relaxare afectată la acetilcolină, care este compensată de producția de ROS.

nitric

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Șoarecii masculi de tip sălbatic (WT) C57BL/6J au fost crescuți în laboratoarele noastre. Șoarecii homozigoti iNOS KO pe fundal C57BL/6J au fost un cadou amabil de la Dr. A.J. Hobbs (University College London). Obezitatea a fost indusă prin hrănirea șoarecilor cu o dietă bogată în grăsimi (5.286 kcal/kg; Bioserve) de la înțărcare. Animalele de control au fost hrănite cu o dietă standard. Șoarecii au fost adăpostiți într-o instalație convențională pentru animale cu un ciclu de lumină: întuneric de 12: 12 ore. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Regatul Unit. Legea privind procedurile științifice (1986) privind funcționarea animalelor.

Evaluarea reglării metabolice, a lipidelor plasmatice și a nitriților din plasmă.

După 4 și 8 săptămâni de hrănire, testele de toleranță la glucoză și insulină au fost efectuate la șoareci conștienți prin prelevarea repetată a sângelui după o injecție intraperitoneală de glucoză (1 mg/g) sau insulină umană (0,75 unitate/kg), așa cum s-a descris anterior (22) . Glicemia a fost măsurată folosind un dispozitiv portabil (Hemocue, Sheffield, Marea Britanie), iar nivelurile de insulină au fost evaluate printr-un radioimunotest hipersensibil specific (Linco Research, St. Charles, MO). Scorul de sensibilitate la insulină a evaluării modelului homeostatic (HOMA) a fost calculat ca insulină × glucoză ÷ 22,5. Probele de sânge au fost obținute din vena safenă laterală, iar nivelurile de glucoză au fost măsurate în sângele integral. Acizii grași liberi și trigliceridele au fost măsurate în plasmă de post folosind teste colorimetrice (Roche, Mannheim, Germania; ThermoTrace, Victoria, Australia). Nitritul plasmatic a fost măsurat utilizând reacția Griess (14).

Măsurarea in vivo a tensiunii arteriale.

Tensiunea arterială sistolică a fost măsurată utilizând pletismografie cu coș (22,23) la șoareci conștienți preîncălziți timp de 10 min într-un dispozitiv de control termostatic (XBP1000; Kent Scientific). Trei sesiuni de antrenament au fost efectuate în timpul săptămânii înainte de efectuarea măsurătorilor. Media de cel puțin șase înregistrări separate de trei ori a fost luată pentru a calcula tensiunea arterială sistolică medie.

Evaluarea ex vivo a funcției vasculare.

Răspunsul vascular mediat de NO la insulină a fost evaluat prin construirea de curbe de doză-răspuns de fenilefrină înainte și după o expunere de 2 ore la insulină (100 mU/ml). Am demonstrat anterior la șoareci sănătoși că insulina determină tocirea dependentă de endoteliu a răspunsului vasoconstrictor la fenilefrină și că acest efect este abolit de l-NMMA; adică nu este mediat de NO (23).

Măsurarea in situ a producției vasculare a speciilor reactive de oxigen.

Generarea ROS în aorta in situ a fost măsurată utilizând fluorescența dihidroethidium (DHE), după cum sa raportat anterior (24,26). Pentru a explora posibilitatea ca producția de ROS vascular să fie stimulată de acetilcolină, fluorescența DHE a fost evaluată în inele aortice care fuseseră expuse la acetilcolină sau soluție salină. Intensitatea fluorescenței la suprafața endotelială a fost cuantificată microscopic din cel puțin cinci câmpuri aleatorii (1.024-1.022 pixeli; 269,7 × 269,2 μm) per diapozitiv și trei diapozitive pe condiție experimentală, utilizând un sistem computerizat de analiză a imaginii (Improvizare).

Exprimarea ARNm NOS în aortă.

ARN-ul total a fost extras din aortă (Mini Fibrous Kit; Quiagen) și cantități egale au fost transcrise invers folosind Superscript II RT (Invitrogen) și oligonucleotide decamer aleatorii. Analizele RT-PCR în timp real pentru expresia ARNm eNOS, nNOS, iNOS și β-actină au fost efectuate în duplicat folosind sistemul de detectare a secvenței ABI Prism 7000 (23). Au fost utilizate grunduri și sonde marcate cu FAM specifice acestor gene (teste la cerere; Biosisteme aplicate). ADNc a fost amplificat în următoarele condiții: 10 min la 95 ° C, urmat de 40 de cicluri de 15 s la 95 ° C și 1 min la 60 ° C. Metoda curbei standard (Buletinul utilizatorului nr. 2; Sisteme ABI) a fost utilizată pentru cuantificare, iar rezultatele au fost normalizate pentru exprimarea β-actinei.

analize statistice.

Datele sunt mijloace ± SE. Comparațiile au fost făcute folosind un test t nepereche, ANOVA unidirecțional sau ANOVA cu măsuri repetate, după caz. P l -NMMA asupra răspunsurilor vasoconstrictoare la fenilefrină. După 4 sau 8 săptămâni de hrănire, a existat un răspuns constrictor mai mare cu l-NMMA la obezi decât la șoareci slabi: la 4 săptămâni, modificarea tensiunii ca răspuns la l-NMMA la șoareci obezi versus slabi a fost de 86,4 ± 21,0 vs. 35,4 ± 12,9% (P l-NMMA. Șoarecii INOS KO hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi au avut un răspuns constrictor similar în comparație cu șoarecii WT sau iNOS KO hrăniți cu dieta standard (Fig. 6C). În concordanță cu o reducere a producției totale de NO, Șoarecii iNOS KO hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi au avut mai puțini nitriți plasmatici decât șoarecii WT din aceeași dietă (12,0 ± 0,3 față de 16,9 ± 1,45 μmol/l; P = 0,02) Șoarecii iNOS KO hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi au fost, de asemenea, protejați împotriva pierderea vasodilatației mediată de insulină (Figurile 5B și D); totuși, au dezvoltat încă tensiune arterială crescută (Tabelul 1.) Mai mult, șoarecii iNOS KO din dieta obezogenă au prezentat dovezi de vasodilatație mediată de ROS în aortă în același mod la fel ca șoarecii WT (Fig. 6B), precum și creșterea producției de ROS în testul de fluorescență DHE (Fig. 6A).

DISCUŢIE

Obezitatea este o problemă majoră de îngrijire a sănătății în lumea occidentală și urmează să atingă proporții epidemice în următorii 20 de ani. O consecință majoră a obezității este boala vasculară prematură. Înțelegerea mecanismelor care leagă obezitatea de disfuncția endotelială este un obiectiv important. Studiul de față a demonstrat o serie de constatări importante pentru înțelegerea noastră a relațiilor dintre obezitate, rezistența la acțiunile glucoreglatorii și vasculare ale insulinei și funcția vasodilatatoare dependentă de endoteliu, precum și rolul NO derivat din iNOS în aceste diferite fațete ale obezității. perturbări metabolice și vasculare asociate.

Vasodilatație dependentă de ROS în obezitatea timpurie.

Dovezi în creștere au subliniat un rol important pentru ROS și stresul oxidativ în bolile vasculare. ROS poate juca un rol critic în modularea căilor de semnalizare sensibile la redox și sunt implicate în creșterea celulară a mușchiului neted vascular și în hipertrofie (31). Astfel, deși vasodilatația dependentă de ROS observată în prezentul studiu poate fi considerată ca fiind potențial benefică, pe termen lung, creșterea producției de ROS în vasculatură poate fi dăunătoare prin promovarea proceselor dezadaptative, cum ar fi proliferarea celulară (32). Mai mult, și având o relevanță deosebită pentru prezentul studiu, producția simultană de O2 - și NO conduce la o producție aproape limitată de difuzie a speciei reactive, peroxinitrit (ONOO -). Se consideră că peroxinitritul joacă un rol în dezvoltarea vasculopatiei asociate cu obezitatea și diabetul printr-o serie de mecanisme, inclusiv nitrozilarea proteinelor (33). Într-un studiu realizat de Marfella și colab. (34), șoarecii iNOS KO diabetici prin streptozotocină au fost protejați împotriva formării nitrotirozinei tisulare după infarctul miocardic. Efectul iNOS KO asupra peroxinitritului indus de obezitate în țesutul vascular justifică un studiu suplimentar.

Mecanisme care stau la baza dezvoltării hipertensiunii în obezitate.

Rolul iNOS în obezitate și relația cu inflamația.

În studiul de față, am reușit să discernem contribuția probabilă a iNOS la anomaliile identificate în timpul progresiei obezității. În obezitatea timpurie, am găsit dovezi ale unei creșteri semnificative, mai degrabă decât a unei reduceri a NO bazal utilizând mai multe abordări diferite. Am demonstrat un răspuns vasoconstrictor crescut la inhibitorul NOS neselectiv l-NMMA, un efect al obezității care s-a pierdut la șoarecii iNOS KO. Un rol pentru iNOS a fost susținut în continuare de efectul inhibitorului specific iNOS 1400W de a crește tonusul în aorta șoarecilor obezi, în timp ce nu a fost observat niciun efect la șoarecii slabi. S-au observat dovezi ale creșterii producției de NO a întregului corp la nivelurile crescute de nitrit plasmatic la șoarecii obezi, care au fost tociti la șoarecii iNOS KO. În cele din urmă, s-a constatat că expresia iNOS a crescut semnificativ în aorta șoarecilor obezi.

Studiile anterioare efectuate pe vase expuse la citokine inflamatorii, șoarecii reduși septic folosind injecția lipopolizaharidei (17) și studiile de transfer al genei iNOS au susținut cu toții un rol pentru NO derivat din iNOS în provocarea disfuncției vasculare (18,19). Dacă se consideră obezitatea o afecțiune inflamatorie similară cu sepsisul de grad scăzut, șoarecii iNOS KO ar putea fi așteptați să fie protejați împotriva disfuncției endoteliale clasice, așa cum s-a demonstrat că este cazul în sepsis (17). Cu toate acestea, acest lucru nu a fost observat în prezentul studiu, unde șoarecii iNOS KO obezi au avut încă dovezi de vasodilatație mediată de ROS care maschează disfuncția endotelială sub acoperire. Într-o constatare interesantă, am observat că, în ciuda glucocompetenței păstrate, șoarecii obezi iNOS KO au dezvoltat presiuni sanguine crescute la fel cum au făcut șoarecii WT obezi.

Implicațiile potențiale ale prezentului studiu.

Deși studiul actual a fost realizat la șoareci, ar putea avea implicații relevante clinic la om. Dacă se joacă mecanisme similare în obezitatea indusă de dieta umană, NO derivat din iNOS poate fi o țintă rezonabilă pentru încetinirea progresiei rezistenței la acțiunile metabolice și vasculare ale insulinei. Cu toate acestea, pe baza studiului actual, o astfel de abordare ar putea să nu aibă efecte favorabile asupra tensiunii arteriale și a disfuncției endoteliale la obezitate. Prin urmare, protejarea vasculaturii în obezitate și stări rezistente la insulină va necesita o abordare integrată, grăsimea totală fiind probabil un factor cheie.