Există multe organisme natural bioluminescente existente în natură și mecanismele prin care unele dintre aceste creaturi emit lumină au fost pe deplin caracterizate1. Acestea includ sistemul luciferină-luciferază al bacteriilor, insectelor (licuricii și gândacilor-clic) și meduzele Aequorea victoria. În esență, bioluminiscența implică conversia energiei chimice în energie luminoasă de către o enzimă, denumită în mod obișnuit luciferază.

analiza

Luciferazele din diferite organisme catalizează reacții diferite, dar toate necesită oxigen. De-a lungul anilor a existat un mare interes în dezvoltarea aplicațiilor bazate pe bioluminiscență2,3. Un avantaj major al utilizării sistemelor bioluminescente ca instrumente analitice este că nivelurile extrem de scăzute de activitate enzimatică pot fi detectate prin măsurarea luminii emise. Instrumentele moderne sunt capabile să detecteze fotoni unici cu distribuție temporală și spațială; oferind astfel informații exacte despre locația și intensitatea sursei de lumină4. O altă caracteristică a sistemelor bioluminescente care le face un instrument de investigație excelent este o specificitate aproape absolută pentru substraturile lor. De exemplu, pentru luciferaza cu licurici, chiar și modificări minore în structura ATP și luciferină cu licurici duc la o pierdere totală a activității enzimatice, ceea ce duce la o pierdere a emisiilor de lumină. Această specificitate pentru substraturi permite măsurarea în timp real a activității luciferazei in situ în probe foarte complexe, fără a fi nevoie de nici un pre-tratament.

Bioluminiscență ATP

Cea mai cunoscută dintre metodele bioluminescente este testul ATP, bazat pe activitatea luciferazei cu licurici (Figura 1). Această analiză a fost utilizată pentru a determina biomasa și se bazează pe principiul că toate celulele vii conțin ATP, iar nivelurile de ATP sunt proporționale cu numărul de celule prezente. Astfel, cantitatea de lumină emisă de reacția luciferază/luciferină după extragerea ATP din celule oferă o estimare a populațiilor de celule. Această analiză a fost aplicată pentru a estima încărcătura microbiană într-o varietate de alimente, inclusiv lapte 5-10, carne de pasăre 11-14, carne 15, 16 și produse17. Rezultatele pot fi obținute în aproximativ 15 minute și oferă o indicație exactă dacă numărul a depășit pragurile prestabilite. Bioluminiscența ATP a fost, de asemenea, utilizată pentru a monitoriza calitatea apelor de procesare în timpul fabricării alimentelor 11, 18.

Webinar: peisajul alternativelor lactate pe bază de plante și provocările sale tehnice

Odată cu schimbarea dinamică a tendințelor și din ce în ce mai mulți jucători care intră în diferențierea pieței de produse lactate pe bază de plante, devine o cheie. Există o mulțime de produse pentru care consumatorii pot alege și este mai dificil ca niciodată să ieși în evidență.

Probabil că cea mai utilizată aplicație a acestei tehnologii este „Monitorizarea igienei ATP”. Aceasta implică evaluarea nivelurilor de ATP pe tampoane de mediu care se referă direct la curățenia suprafeței19, 20. Sunt disponibile mai multe sisteme comerciale (Figura 2). S-a ridicat îngrijorarea cu privire la inhibarea luciferazei în prezența dezinfectanților rămași pe suprafețe după igienizare21-23. O modalitate elegantă de a depăși această problemă este utilizarea luciferazelor mutante cu rezistență crescută la dezinfectanții utilizați în industrie24. Într-o răsucire a monitorizării igienei, sa propus ca aceste teste să poată fi utilizate și pentru a evalua potențialul prezenței alergenilor pe suprafețele de contact cu alimentele.

Folosind metode pentru extracția diferențială a ATP din celulele procariote și eucariote, a fost posibil să se dezvolte teste pentru celulele microbiene care pot fi efectuate în câteva minute. Cu toate acestea, limita de detectare pentru aceste teste este ridicată (> 106 CFU/ml), iar metodele de îmbunătățire a sensibilității acestora au fost o preocupare a multor microbiologi în ultimele două sau trei decenii. Pentru a îmbunătăți sensibilitatea, tehnicile care implică filtrarea sau centrifugarea au fost investigate și acestea au făcut posibilă detectarea a aproximativ 104 CFU/ml în alimente. Această sensibilitate poate fi îmbunătățită în continuare prin teste de adenilat kinază, o enzimă prezentă în celule care poate fi făcută să producă ATP prin adăugarea de ADP în exces26. O altă metodă de creștere a sensibilității care implică reciclarea ATP prin combinarea enzimei piruvat orto-fosfat dikinază cu luciferază/luciferină a fost propusă de Sakakibara și colab. Acești autori susțin că metoda lor este de aproximativ 40 de ori mai sensibilă decât cea bazată doar pe reacția luciferază/luciferină.

Diagnostic pe bază de fagi

Un alt dezavantaj al testelor de bioluminiscență ATP este incapacitatea lor de a distinge între tipurile de organisme prezente fie în alimente, fie pe suprafețele de contact cu alimentele. Acest lucru a fost abordat într-o varietate de moduri. Recent, a existat interes în cuplarea testelor de bioluminiscență ATP cu separarea imunomagnetică 28, 29, dar principalul dezavantaj al acestui fapt este posibilitatea legării nespecifice a microorganismelor de granulele paramagnetice utilizate în tehnică. A apărut un sistem comercial care utilizează bacteriofag specific gazdei pentru a liza bacteriile țintă și adenilat kinaza care este eliberată poate fi testată folosind o metodă bioluminiscentă30. Aceasta constituie baza testului fastrAK furnizat de Alaska Food Diagnostics.

Bacteriofagii au fost utilizați în alte moduri pentru a detecta agenții patogeni utilizând o platformă bioluminiscentă. Mai mulți cercetători au folosit bacteriofage modificat pentru a transporta gene reportere luminescente sau fluorescente31. Când celula gazdă este infectată de fag, genele raportoare sunt exprimate și lumina este permisă. S-a demonstrat că această metodă poate fi utilizată pentru detectarea directă a bacteriilor de pe suprafețele alimentelor32. Pe lângă genele structurale care codifică enzimele implicate în reacția de bioluminiscență, cercetătorii au construit fagul care conține gena luxI care codifică un compus de semnalizare care induce apoi alte câteva gene, luxCDABE, a cărui activare duce la bioluminescență într-o bacterie raportor prezentă pe un biosenzor33. . De asemenea, s-a propus ca fagul biotinilat cuplat cu nanocomplexele cu puncte cuantice să poată fi utilizat pentru a detecta bacteriile34. În prezent, investigăm metode de imobilizare a fagului care vor face posibilă concentrarea și detectarea bacteriilor într-o singură etapă35.

Biosenzori și alte aplicații

O aplicație interesantă a bioluminiscenței este biosenzorul „CANAR”. Aceasta implică o celulă macrofagă care prezintă pe suprafața sa anticorpi patogeni specifici36. Când celula țintă se leagă de anticorp se declanșează căi de semnalizare naturale în celulă care pot fi detectate de către echorină, care este exprimată de macrofag (Figura 3). Biosenzorul este comercializat de Innovative Biosensors, Inc. și a fost aplicat la detectarea E. coli O157: H7 în carne de vită măcinată.

Testele bioluminiscente au fost, de asemenea, dezvoltate pentru detectarea substanțelor toxice, a antibioticelor și a metaboliților celulari.

Multe cercetări recente s-au concentrat pe imagistica in vivo a agenților patogeni bacterieni care au fost modificați genetic pentru a transporta genele luciferazei. Eficacitatea tratamentelor pentru prevenirea infecțiilor de origine alimentară poate fi determinată folosind această tehnică37.

Pe lângă construirea pe aplicațiile actuale, există mai multe oportunități noi și interesante oferite microbiologilor prin bioluminiscență.