1 Program de cercetare și resurse în domeniul alergiei alimentare, Departamentul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea din Nebraska, Lincoln, NE 68588-6207, SUA

test

2 Ministerul Agriculturii și Afacerilor Rurale, Direcția pentru Controlul Alimentelor și Cercetarea Alimentară Centrală, 16036 Bursa, Turcia

Abstract

1. Introducere

Reacțiile alergice la ingestia de semințe de susan pot fi declanșate de doze de până la 1 mg de proteine ​​din semințe de susan pentru cazuri individuale, iar studiul pragului populației a arătat că aproximativ 5 mg de proteine ​​din semințe de susan declanșează o reacție în 10% din semințele de susan. -populația alergică [5]. Semințele de susan conțin mai multe proteine ​​alergenice care au fost identificate și parțial caracterizate [6-9]. Uleiul de susan poate prezenta, de asemenea, un pericol pentru persoanele alergice la semințe de susan, deoarece nu este adesea foarte rafinat și conține astfel reziduuri de proteine ​​[10].

2. Materiale și metode

2.1. Prepararea imunogenului
2.2. Producția de anticorpi policlonali

O capră a fost imunizată cu 1,0 mg de imunogen degresat de semințe de susan emulsionat cu CFA și administrat subcutanat (s.c.). Prima injecție de rapel, compusă din 500 μg imunogen de semințe de susan în IFA, a fost administrat la 2 săptămâni după imunizarea inițială. Injecțiile de rapel ulterioare au fost administrate cu 250 μg de semințe de susan degresate în IFA la fiecare 3 săptămâni după aceea, alternând între s.c. și intramuscular (i.m.). Prima sângerare de test a fost luată după a doua injecție de rapel (aproximativ 5 săptămâni după injecția inițială), iar ulterior sângerările de test au fost luate la 10 zile după fiecare injecție de rapel.

Trei pui au fost inițial imunizați cu imunogen degresat din semințe de susan în CFA, urmat de injecții de rapel la intervale de 2 săptămâni folosind 200 μg în IFA (s.c. și i.m., alternativ) practic conform Schade și colab. [15]. La opt săptămâni după imunizarea inițială, acest grup a fost odihnit timp de aproximativ 6 săptămâni, iar apoi injecțiile de rapel au fost schimbate la intervale de 3 săptămâni din cauza unei scăderi observate a producției de anticorpi.

Dezvoltarea titrului a fost monitorizată folosind un ELISA necompetitiv, practic descris de Hefle și colab. [16]. Pe scurt, plăcile de microtitrare (MaxiSorp, Nagle Nunc International, Roskilde, Danemarca) au fost acoperite cu 1 μg proteine ​​din semințe de susan/ml tampon de acoperire (0,015 M Na2CO3, 0,035 M NaHCO3 și 0,02% NaN3, pH 9,6) și incubate peste noapte la 4 ° C. După blocare cu 350 μL de PBS conținând 0,1% gelatină (porcine, 300 de flori, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), seruri din gălbenușuri de capră sau de pui au fost incubate în diferite diluții. Plăcile au fost spălate cu PBS conținând 0,05% Tween 20, iar IgG de capră legat și IgY de ou au fost detectate și cuantificate folosind conjugate comerciale anti-imunoglobulină-fosfatază alcalină (anti-capră IgG [Pierce Chemical Co., Rockford, IL]; anti-pui IgY [Promega Co., Madison, WI]), respectiv, urmând instrucțiunile producătorului. Sângerările de la capră cu titruri peste 10.000 au fost combinate. Gălbenușurile cu titruri> 3.000 au fost reunite.

2.3. Izolarea anticorpilor

Anticorpii policlonali IgG au fost parțial purificați din ser prin precipitare în 50 și 35% sulfat de amoniu [16]. IgG parțial purificat a fost scurt dializat împotriva apei deionizate și apoi a fost dializat extensiv împotriva soluției saline tamponate cu fosfat 0,01 M (PBS) (0,002 M NaH2PO4, 0,008 M Na2HPO4, 0,85% NaCl și 0,02% NaN3, pH 7,4) așa cum este descris de Hefle et. al. [16]. Această fracțiune IgG a fost utilizată ca anticorp de acoperire pentru dezvoltarea ELISA. Ouăle imune au fost colectate și depozitate la 4 ° C până la nevoie. Fracția IgY a fost purificată utilizând un sistem comercial de purificare EGGstract IgY (Promega Co., Madison, WI). Preparatele de imunoglobulină Y au fost depozitate la -20 ° C până la nevoie. Această fracțiune IgY a fost utilizată ca anticorp de detectare în dezvoltarea ELISA. Conținutul de proteine ​​al fracțiilor IgG (48,5 mg/ml) și IgY (7,7 mg/ml) a fost determinat prin metoda Lowry [17].

2.4. Electroforeza pe gel și imunoblotarea
2.5. Sandwich ELISA
2.6. Curba standard pentru Sandwich ELISA

Curbele standard au fost construite cu extracte de amestec de pâine cu vârfuri cunoscute de susan sub formă de făină de semințe de susan. Apoi, 454 grame de amestec de pâine uscată (Hodgson Mills, lotul 10 07 09 2) au fost amestecate cu cantitatea necesară de făină de semințe de susan pentru a obține 1.000 ppm în rețeta finală. Această cantitate va avea ca rezultat o concentrație de 0,01% sau 100 ppm după adăugarea celorlalte ingrediente (greutatea totală de 742 g). Alte 454 de grame de amestec de pâine uscată au servit drept control negativ. La 454 grame amestec de pâine uscată, s-au adăugat 30 grame ulei vegetal, 6 grame drojdie proaspătă și 252 grame apă, rezultând o greutate totală de 742 grame. Extractele au fost făcute din amestecul de pâine cu pâine cu 1000 ppm și amestec de pâine cu pâine cu 0 ppm (așa cum este descris mai jos) și aceste extracte au fost amestecate în diferite rapoarte pentru a obține diluțiile necesare pentru curba standard. Curbele standard au fost generate utilizând software-ul grafic Prism (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA).

2.7. Comparație cu testele comerciale de semințe de susan

Kituri ELISA disponibile comercial pentru semințe de susan au fost obținute de la Tepnel Biokits (Deeside, Marea Britanie) și ELISA Systems (Windsor, Australia). Testele au fost furnizate ca kituri gata de utilizare, cu toți reactivii, diluanții și standardele incluse și au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Testul Tepnel Biokits a avut un domeniu de detectare revendicat de la 6 la 100 ppm, testul ELISA Systems de la 0,5 la 5 ppm. Extractele au fost pregătite conform instrucțiunilor producătorilor de truse.

2.8. Mostre alimentare

Toate probele de alimente au fost achiziționate de la comercianții cu amănuntul locali din Lincoln, Nebraska. Nouăzeci și șapte de alimente sau ingrediente alimentare au fost evaluate pentru reactivitatea încrucișată și efectele matricei în ELISA. Toate probele au fost măcinate la consistență uniformă utilizând un blender Oster (Oster Professional Products, Chicago, IL) sau un mortar și pistil în funcție de textura probelor.

2.9. Hrană naturală: Pâine cu făină de semințe de susan

Amestecul de pâine cu vârf de semințe de susan de 100 ppm (sub formă de făină de susan) și amestecul de pâine cu control negativ au fost preparate așa cum s-a descris pentru prepararea curbei standard a sandwich-ului ELISA. Amestecul de pâine cu țepi și amestecul de pâine cu control negativ au fost amestecate în diferite rapoarte, astfel încât concentrațiile de 100 ppm, 50 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 1 ppm și 0 ppm au fost atinse în pâinea finală. Din aceste amestecuri, pâinea a fost coaptă folosind un panificator automat (setări implicite). După răcire la temperatura camerei, au fost prelevate probe din diferite locații din pâine.

2.10. Mâncare suportată în mod natural: Unt de arahide înțepat cu Tahini

Tahini și unt de arahide au fost obținute de la un supermarket local. Un standard cu vârf de 10.000 ppm semințe de susan în unt de arahide a fost preparat amestecând tahini și unt de arahide într-un raport 1/100 (W/W). Amestecul a fost amestecat extensiv folosind un blender de bucătărie. Produsul de 10.000 ppm s-a folosit pentru a scufunda untul de arahide în următoarele concentrații: 100 ppm, 50 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 1 ppm și 0 ppm. Toate probele au fost amestecate extensiv înainte de analiză.

2.11. Pregătirea extraselor pentru ELISA

Semințele de probe au fost măcinate cu un râșniță de cafea înainte de extragere. Datele preliminare au indicat faptul că metodele mai puțin riguroase de măcinare au dat recuperări relativ scăzute atunci când semințele de susan intacte erau prezente (nu sunt prezentate). Probele de sol au fost extrase 1:10 (g/v) în 0,01 M PBS timp de 2 ore la temperatura camerei cu agitare ușoară folosind un agitator Labquake (Barnstead/Thermoline, Dubuque, IA). Extractele au fost clarificate prin centrifugare la 3.200 × g la 10 ° C într-o centrifugă Sorvall (Kendro Laboratory Products, Newtown, CT). Extractele proaspete au fost utilizate și depozitate la 4 ° C timp de până la 5 zile.

Extractele pentru testarea reactivității încrucișate au fost testate sub formă nediluată, diluată de 10 ori din, și formă diluată de 100 de ori, iar rezultatele au fost calculate ca echivalență a semințelor de susan ppm folosind reactivitatea 1.000.000 ppm pentru semințe de susan prin definiție.

3. Rezultate si discutii

3.1. Caracterizarea anticorpilor

) a indicat un rol important pentru globulina 11S, Ses i 6 și Ses i 7, în special subunitatea sa de bază de aproximativ 25 kDa [9]. Deși nu am identificat proteinele și alergenii la care anticorpii policlonali au fost reactivi, observăm o reactivitate bună în regiunea cu greutate moleculară mică tipică pentru albumine și oleozine 2S, reflectând probabil reactivitatea la Ses și 1, Ses și 2, Ses și 4, Ses i 5 și/sau subunitatea de bază a Ses i 6 și Ses i 7. Mai mult, vedem o reactivitate clară a ambilor anticorpi policlonali în regiunea de 45 kDa, care corespund probabil Ses Ses 3. Deoarece semințele de susan sunt utilizate ca alimente ingredient ca semințe intacte, ca făină sau ca pastă făcută din semințe întregi, este puțin probabil ca alergenii individuali să se separe între ei în timpul procesării alimentelor. Prin urmare, dacă un set de anticorpi recunoaște mai multe proteine ​​sau alergeni, acestea sunt potențial adecvate pentru utilizare în dezvoltarea unui ELISA pentru a detecta reziduurile de semințe de susan într-o gamă de produse alimentare.


3.2. Sensibilitatea ELISA

Cu anticorpii policlonali crescuți în capră și pui, s-a dezvoltat un sandviș ELISA folosind anticorpul de capră ca strat și anticorpul IgY de gălbenuș de ou de pui ca detector. Sandwich-ul ELISA a fost testat pentru sensibilitate prin măsurarea unei game de concentrații cunoscute de extract de făină de semințe de susan cu vârf într-un amestec de pâine. În Figura 2, este prezentat un exemplu tipic al mediei a 9 teste independente. Gama sensibilă este de la 0,15 la 37 ppm de semințe de susan în amestecul de pâine. Cel mai scăzut standard testat a fost de 0,02 ppm; cu toate acestea răspunsul acestui eșantion a fost apropiat de semnalul de fundal. Probele de 0,5 ppm au dat în mod constant absorbanțe care erau cu mult peste semnalul de fundal și, prin urmare, am folosit 0,5 ppm ca limită inferioară de cuantificare (LLOQ). Se poate face interpolare între 0,5 și 0,02 ppm, dar rezultatele calculate pot fi impresionante.


Alte teste pentru detectarea reziduurilor de semințe de susan în produsele alimentare au fost descrise anterior pe baza fie a metodologiei imunochimice, fie a metodologiei de amplificare a ADN-ului. Sensibilitatea metodelor imunochimice a variat de la 0,6 ppm proteină de susan (sandwich ELISA [12]) la 5 ppm de proteină de susan (inhibare ELISA [11]). Sensibilitatea metodei de amplificare a ADN-ului a fost într-un raport 50 ppm [13] și 5 ppm într-un alt raport [14]. Cel puțin una dintre aceste metode de Schöringhumer și colab. [13] este posibil să nu detecteze niveluri relevante clinic de reziduuri de semințe de susan pe baza dozei de referință VITAL [22]. Mai mult, metodele de amplificare a ADN-ului detectează ADN-ul mai degrabă decât partea proteică alergenică a semințelor de susan. Rezultatele obținute cu metode de amplificare a ADN-ului ar trebui, prin urmare, interpretate cu mai multă atenție, în special pentru produsele alimentare procesate care conțin ingrediente pe bază de semințe de susan în care partea proteică alergenică este separată de fracția ADN/ARN.

3.3. Specificitatea ELISA
3.4. Compararea diferitelor imunoanalize pentru semințele de susan: recuperarea din diferite matrice

Condițiile de procesare a alimentelor, în special tratamentul termic, cum ar fi coacerea, duc adesea la recuperarea redusă a alergenilor atunci când se testează cu imunoanalize. De asemenea, produsele alimentare care au un conținut ridicat de grăsimi sunt cunoscute ca fiind matrici dificile pentru detectarea reziduurilor de alergeni [28]. Pentru semințele de susan, recuperarea din pâinea integrală a fost descrisă ca fiind mai mică decât se aștepta [11]. Am comparat testul nostru dezvoltat în prezent cu două teste disponibile în comerț pentru detectarea reziduurilor de semințe de susan în ceea ce privește recuperarea din matricile alimentare dificile. Au fost pregătite două produse alimentare tip: pâine coaptă din făină cu făină de semințe de susan și unt de arahide cu thaini. Pentru testele comerciale, a fost utilizată procedura de extracție recomandată de producătorul kitului.

Semința noastră de susan ELISA a fost, de asemenea, comparată cu cele două truse ELISA comerciale după ce a pătruns unt de arahide cu cantități cunoscute de tahini (Tabelul 3). Așa cum s-a explicat pentru tabelul 2, standardele diluate au fost din nou utilizate pentru a obține informații despre recuperarea reziduurilor de semințe de susan în produsele alimentare cu un nivel scăzut de pastă de semințe de susan. Din nou, aceasta nu este o cuantificare adevărată, dar datele sunt incluse în Tabelul 3 în scop informativ. Pentru produsul alimentar model tahini, testul actual a arătat cea mai bună recuperare (medie: 83%), în timp ce testul Tepnel-Neogen a dus la o supraestimare a conținutului de susan (recuperare medie: 239%). Testul de la ELISA Systems a avut o recuperare medie de 6% și nu a putut detecta cea mai mică concentrație de vârf de 1 ppm pastă de semințe.

Recuperarea alergenilor alimentari din produsele alimentare pentru detectare și cuantificare a făcut obiectul investigației de ceva timp. Majoritatea lucrărilor publicate se referă la detectarea arahidei. Recuperarea din produse de ciocolată și cookie-uri a fost testată pentru diferite teste (disponibile în comerț) în testele inelare. Un studiu special care a inclus 5 teste diferite pentru reziduurile de arahide și 30 de laboratoare europene a constatat recuperări cuprinse între 44 și 191% pentru creșteri cu ppm scăzute [29]. Pentru testele de semințe de susan, nu există astfel de studii cuprinzătoare pe inel. Dintre cele două imunoanalize raportate pentru a detecta reziduurile de semințe de susan, recuperările au variat între 70 și 160% [11] și 42 până la 145% [12]. Nu au fost utilizate alte teste în aceste studii și au fost testate doar produse de panificație, limitând aplicabilitatea generală a datelor lor la o gamă mai largă de produse alimentare.

4. Observații finale

A fost dezvoltat un set de anticorpi policlonali pentru detectarea proteinelor din semințe de susan. Sandwich-ul ELISA construit cu acești anticorpi a fost sensibil și specific pentru detectarea reziduurilor de semințe de susan. Cu toate acestea, recuperarea din produsele alimentare coapte a fost scăzută. Alte teste par să aibă recuperări mai bune pentru anumite produse alimentare. Datele actuale arată că pot fi necesare teste diferite pentru a măsura în mod fiabil reziduurile de semințe de susan în diferite produse alimentare și că trebuie acordată o atenție deosebită la evaluarea nivelului de reziduuri de semințe de susan în produsele alimentare.

Conflict de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

Confirmare

Autorii doresc să recunoască rolul de lider al regretatei profesoare Susan Hefle în acest proiect de cercetare. Profesorul Hefle a inițiat acest proiect de cercetare și a condus proiectarea abordărilor experimentale.

Referințe