Un model genetic nonobez normolipidemic al diabetului de tip 2 indus de dietă care exprimă diferențele sexuale

  1. 12. Sara Weksler-Zangen,
  2. Chana Yagil 1,
  3. David H. Zangen,
  4. Asher Ornoy 2,
  5. Howard J. Jacob 4 și
  6. Yoram Yagil 1

  1. 1 Laborator de Medicină Moleculară, Facultatea de Științe ale Sănătății, Universitatea Ben-Gurion, Campus Centrul Medical Barzilai, Ashkelon, Israel
  2. 2 Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Ebraică și Școala de Medicină Hadassah, Ierusalim, Israel
  3. 3 Departamentul de Pediatrie, Spitalul Universitar Hadassah, Ierusalim, Israel
  4. 4 Departamentul de fiziologie Molecular and Human Science Research Center, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, Wisconsin

Un model genetic nonobez normolipidemic al diabetului de tip 2 indus de dietă care exprimă diferențele sexuale

Abstract

Deși stabilit în urmă cu aproape 30 de ani (16), modelul de șobolan diabetic Cohen a fost studiat până de curând doar într-o măsură limitată. Un dezavantaj major al acestui model a fost că nu a fost niciodată caracterizat sistematic în termeni de fenotip sau genotip, rezultând doar o recunoaștere limitată a valorii sale și a contribuției potențiale la cercetarea diabetului. Ne-am angajat sarcina de a revigora modelul, urmărind să-l facem adecvat pentru studii metabolice, fiziopatologice și genetice și să-l punem la dispoziția cercetătorilor din întreaga lume. Am inițiat un program de consangvinizare selectivă secundară a coloniei originale pentru a asigura omogenitatea maximă fenotipică și genotipică a tulpinilor respective. Ulterior, am studiat fenotipul tulpinilor rezultate și am stabilit astfel pentru prima dată o bază de date actualizată de referință pentru acest model. De asemenea, am determinat genotipul tulpinilor pentru a verifica omogenitatea genetică, pentru a asigura lipsa de contaminare încrucișată între tulpini, pentru a determina gradul de polimorfism ADN dintre tulpini și pentru a identifica markeri informativi pentru viitoarele experimente de încrucișare. Oferim detalii despre fenotipurile și genotipul produselor consangvinizării reînnoite.

diabetic

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Întreținerea animalelor.

Animalele au fost adăpostite șase pe cușcă și separate prin sex, cu excepția intervalelor de reproducere. În timpul sarcinii și după livrarea de gunoi, femelele au fost adăpostite în cuști individuale. Au fost menținute cicluri diurne de 12 ore de lumină-întuneric. Temperatura camerei a fost menținută între 22 și 25 ° C. Aceste condiții sunt în conformitate cu „Principiile îngrijirii animalelor de laborator” (publicația NIH nr. 85–23, revizuită în 1985) și cu liniile directoare ale Societății Americane de Fiziologie pentru îngrijirea animalelor de laborator.

Ameliorarea coloniei de șobolani diabetici Cohen.

Colonia originală a șobolanului diabetic Cohen fusese deținută de la înființarea sa la unitatea de animale a Universității Ebraice și a Școlii de Medicină Hadassah din Ierusalim, Israel. Consangvinizarea selectivă secundară a fost inițiată la fața locului acum 3 ani. O parte din colonia rezultată a fost ulterior transferată la unitatea de animale a campusului Centrului Medical Barzilai al Universității Ben-Gurion din Ashkelon, Israel, unde s-a continuat consangvinizarea. Experimentele au fost efectuate la ambele site-uri. Creșterea, manipularea și experimentarea animalelor au primit aprobarea comitetelor locale de îngrijire a animalelor din ambele instituții.

Consangvinizare selectivă.

Criteriile de selecție inițiale ale lui Cohen s-au bazat pe un test de toleranță orală la glucoză cu niveluri de glucoză în sânge (BGL) la 2 ore> 180 mg/dl pentru Cohen sensibil la diabet (CD) și 230 mg/dl pentru CD și 125 etichetat anti- anticorpi pentru insulină umană (Medgenix, Bruxelles, Belgia) și insulină nemarcată la concentrații diferite. Reactivitatea încrucișată cu insulină umană purificată (utilizată ca standard) a fost de 90-95%.

Biochimie.

Nivelurile de electroliți plasmatici, creatinină și lipide au fost determinate la animalele de 6 luni anesteziate (xilazină/ketamină) în sânge obținut din bifurcația aortei. Excreția de proteine ​​urinare de 24 de ore a fost determinată în urina colectată în cuști metabolice individuale prin testul de microprecipitare a proteinelor.

Experimente suplimentare.

Severitatea fenotipului diabetic la bărbații cu CD și diferențele de sex între șobolanii cu CD și bărbați care au fost hrăniți cu HSD ne-au determinat să efectuăm două experimente suplimentare: unul conceput pentru a produce un fenotip de lucru intermediar și celălalt pentru a încerca să rezolve problema unui posibil efect hormonal asupra dezvoltării diabetului în această tulpină.

Hrănire alternativă.

Am emis ipoteza că greutatea corporală redusă și eșecul aparent de a prospera la bărbații cu CD cărora li s-a administrat HSD, care reflectă un fenotip diabetic complet, ar putea fi induse de hrănirea zilnică a HSD cu zahăr ridicat și de lipsa tratamentului cu insulină, un afecțiune care simulează diabetul sever netratat la om. Am studiat această ipoteză cu un grup suplimentar de șobolani CD care au primit HSD numai în zile alternative: hrănire intermitentă (IF) în loc de hrănire zilnică (DF).

Gonadectomie.

A doua noastră ipoteză a fost că hormonii sexuali ar putea explica diferențele de sex observate la fenotipul șobolanilor CD masculi și feminini. Gonadectomia chirurgicală sau operația simulată au fost efectuate la șobolani CD masculi și femele la scurt timp după înțărcare, iar animalele au fost hrănite ulterior fie cu RD, fie cu HSD. Animalele nongonadectomizate intacte au servit drept controale. Caracteristicile de creștere au fost monitorizate în ambele seturi de experimente, iar IPGTT a fost efectuat la fiecare grup de animale la 4 și 6 luni.

Genotip.

ADN-ul genomic a fost selectat pentru a găsi polimorfisme de lungime de secvență simplă la animalele reprezentative din CD-urile și tulpinile CDr, folosind 550 de markeri microsateliți (Research Genetics, Huntsville, AL) repartizați uniform în genomul șobolanului. Metodele au fost descrise anterior în detaliu (19,20). Pe scurt, ADN-ul genomic a fost extras din coada șobolanului prin metoda fenol/cloroform. Integritatea, puritatea și cantitatea de ADN extras au fost evaluate prin absorbția spectrofotometrului (GeneQuant II; Pharmacia Biotech, Cambridge, Marea Britanie). Reacția în lanț a polimerazei a fost efectuată pe 50 ng de ADN genomic într-un volum final de reacție de 10 μl conținând 32 de perechi de primer marcate cu P obținute de la Research Genetics. Produsul fiecărei reacții (3 pl) a fost încărcat pe gel de poliacrilamidă. Gelurile au fost rulate pe un aparat Base Ace (Stratagene, La Jolla, CA) și expuse la filmul Kodak XAR-5 pentru autoradiografie. Amplificarea a fost determinată de apariția benzilor discrete. Homozigoza a fost stabilită prin prezența unei singure benzi discrete de interes pentru o anumită tulpină, polimorfism prin apariția migrației diferențiale a produselor de amplificare pentru cele două tulpini și heterozigoitate prin apariția simultană a două benzi aparținând ambelor tulpini.

Analize statistice și gestionarea datelor.

Rezultatele IPGTT au fost analizate prin linia de bază (post), vârf (maxim) și 120-min BGL, precum și după zona de sub curba IPGTT (ASC). Datele sunt furnizate ca medie ± SE. Analizele statistice pentru datele distribuite în mod normal au fost efectuate prin analiza varianței. Semnificația statistică a fost stabilită la P 126 mg/dl la 6 luni, iar șobolanii au devenit astfel evident diabetici.

Vârful BGL.

La vârsta de 5-6 săptămâni, BGL maxime ale CD-urilor și șobolanilor CDr masculi și feminini erau de 210 mg/dl, cu niveluri semnificativ mai mari la bărbați decât la femei (Tabelul 2).

BGL la 14:00.

La vârsta de 5-6 săptămâni, BGL la 2 ore după injecția intraperitoneală au revenit la niveluri sub 100 mg/dl la CD-urile și șobolanii CDr masculi și feminini. La vârsta de 4 și 6 luni, BGL la șobolanii CDr (indiferent de dietă) și la șobolanii CD care au fost hrăniți RD au revenit în mod similar la niveluri sub 100 mg/dl. La 4 luni, nu a existat nicio diferență în aceste grupuri între sexe, dar la 6 luni, BGL au fost mai mici la femei decât la bărbați. La șobolanii CD care au fost hrăniți cu HSD, BGL-urile la 4 și 6 luni au rămas semnificativ crescute, cu niveluri mai mici la femele decât la bărbați (Tabelul 3).

La vârsta de 5-6 săptămâni, ASC a fost similară la CD-urile masculine și feminine și la șobolanii CDr. La 4 și 6 luni, ASC a rămas neschimbată la șobolanii CDr de ambele sexe, indiferent de dietă și la șobolanii femele CD care au fost hrăniți cu RD. La CD-urile de ambele sexe care au fost hrănite cu HSD, ASC a fost dublă sau mai mare decât la șobolanii CDr care au fost hrăniți cu o dietă similară, cu valori semnificativ mai mici la femei decât la bărbați (Tabelul 4).

Experimente IF.

IF a avut ca rezultat un fenotip diabetic intermediar la bărbații CD cu vârsta de 4 și 6 luni, cu un model IPGTT care a fost semnificativ atenuat în comparație cu DF: BGL au fost mai mici la post, la maxim și la 2 ore; ASC a fost mai mică decât la șobolanii CD care au fost hrăniți zilnic, dar semnificativ mai mare decât la șobolanii CDr care au fost hrăniți zilnic sau în zile alternative (Fig. 3).

Experimente de gonadectomie.

Modelul IPGTT al șobolanilor gonadectomizați a prezentat două faze (Fig. 4). În faza incipientă, la 4 luni, curba IPGTT nu a fost diferită de cea a animalelor cu acțiune falsă, atât la bărbați, cât și la femele, cu diferențe de sex evident evidente. Cu toate acestea, la 6 luni, curba IPGTT a fost atenuată în mod izbitor la bărbați în comparație cu simularea, cu un nivel semnificativ mai scăzut de post, vârf și 2-h BGL, precum și ASC. La femele, curba IPGTT la 6 luni a fost ușor atenuată de gonadectomie, singura diferență semnificativă față de animalele care au fost simulate fiind BGL cu vârf mai mic. În consecință, nu a mai existat o diferență în curbă între șobolanii CD masculi și femele care au fost hrăniți cu HSD. Diferențele de sex observate la animalele intacte au rămas astfel neschimbate în faza incipientă a dezvoltării diabetului la 4 luni, dar au fost abolite prin gonadectomie în faza ulterioară la 6 luni.

Nivelurile de insulină plasmatică.

Deoarece nu s-au găsit diferențe de sex la nivelul insulinei în niciunul dintre experimente, datele furnizate sunt combinate pentru bărbați și femei.

Insulina de post.

La animalele în vârstă de 4 luni care au fost hrănite RD sau HSD, nivelurile bazale de insulină de post au fost semnificativ mai mari la CD decât la șobolanii CDr (Tabelul 5). Deoarece BGL de post au fost similare, aceste descoperiri sugerează o stare hiperinsulinemică la șobolanii CD. Nivelurile de insulină atât la CD-uri cât și la șobolani CDr au fost mai mari la animalele care au fost hrănite cu HSD decât atunci când au fost furnizate de RD. La animalele în vârstă de 6 luni, nu a mai existat o diferență în nivelurile de insulină la post între CD și șobolani CDr care au fost hrăniți RD sau HSD, chiar dacă nivelurile de glucoză și insulină au avut tendința de a fi mai mari la șobolanii CD care au fost hrăniți cu HSD, deși nu la un nivel semnificativ statistic.

Răspunsul insulinei la încărcarea intraperitoneală de glucoză.

Nivelurile de insulină la 15 minute după injectarea a 1 g/kg glucoză i.p. la CD-urile de 4 luni, șobolanii care au fost hrăniți cu RD sau HSD au fost semnificativ mai mici decât la șobolanii CDr, în ciuda nivelurilor de glucoză semnificativ mai mari. La 6 luni, s-a observat un model similar de răspuns la insulină (Tabelul 5).

Date biochimice.

Datele biochimice sunt prezentate în Tabelul 6.

Electroliți plasmatici.

Nu au existat diferențe în nivelurile plasmatice de sodiu, potasiu sau clorură între CD și șobolani CDr care au fost hrăniți fie cu dietă, fie între sexe.

Profilul lipidic.

Nivelul colesterolului total și al HDL s-a încadrat în intervalul normal în toate grupurile studiate, fără un model clar care să diferențieze tulpinile, dieta sau sexul. Nivelurile trigliceridelor, deși se încadrează într-un interval normal, au fost mai ridicate, iar nivelurile LDL au fost mai scăzute la CD decât la șobolanii CDr la toți, cu excepția bărbaților care au fost hrăniți cu HSD.

Funcția renală.

Concentrațiile plasmatice ale creatininei au variat între 0,4 și 0,6 mg/dl. Nu au existat diferențe între CD-uri și șobolani CDr, indiferent de dietă sau sex. Excreția de proteine ​​timp de douăzeci și patru de ore a fost de 2 luni o hiperinsulinemie moderată la post și o reducere ulterioară dependentă de vârstă a capacității lor de a secreta insulină ca răspuns la stimularea glucozei. Un răspuns similar la insulină afectat a fost descris și la șobolanii GK (7.28). O posibilă explicație pentru aceste constatări este expunerea prelungită la hiperglicemie în sine, care epuizează capacitatea de secretare a insulinei a pancreasului (13,17,18,28,29,30,31). Cu toate acestea, orice sugestie de deficit absolut de insulină ca urmare a epuizării complete a celulelor β a fost exclusă de constatările noastre. De asemenea, în ceea ce privește nivelurile de insulină plasmatică, este interesant că nu au fost detectate diferențe de sex; astfel, diferențele observate în manipularea glucozei între șobolani CD masculi și femele care au fost hrăniți cu HSD nu au putut fi atribuite diferențelor în secreția de insulină în sine.

În concluzie, produsele consangvinizării selective secundare a CD-urilor și tulpinilor CDr exprimă fenotipuri mai distincte decât fenotipurile diabetice originale descrise de Cohen. Susceptibilitatea (sensibilitatea sau rezistența) la HSD iese în evidență ca semn distinctiv al acestui model. Diferențele sexuale și rolul hormonilor sexuali masculini trebuie să fie investigate în continuare. Screeningul genomului a demonstrat că acest model este foarte potrivit pentru studiile genetice. În cele din urmă, acest studiu oferă pentru prima dată o descriere detaliată și unificată a fenotipurilor metabolice legate de diabetul zaharat și a genotipului noii colonii de șobolani diabetici Cohen - rezultatul unui protocol de studiu controlat sistematic, care va fi utilizat ca bază de date de referință pentru studii viitoare în acest model.