Ralitsa Atanasova

1 Universitatea Pierre et Marie Curie-Paris6, UMR S945, Paris, Franța,

Adela Angoulvant

2 AP-HP, Spitalul Bicêtre, Unitatea de Parazitologie-Micologie, Le Kremlin-Bicêtre, Franța,

3 Université Paris-Sud 11, Institut de Génétique et Microbiologie și CNRS UMR 8621, Orsay, Franța,

Maurel Tefit

1 Universitatea Pierre et Marie Curie-Paris6, UMR S945, Paris, Franța,

Frédérick Gay

1 Universitatea Pierre et Marie Curie-Paris6, UMR S945, Paris, Franța,

4 APHP, Grupul Spitalului Pitié-Salpêtrière, Serviciul Parasitologie-Mycologie, Paris, Franța,

Juliette Guitard

1 Universitatea Pierre et Marie Curie-Paris6, UMR S945, Paris, Franța,

5 INSERM, U945, Paris, Franța,

6 AP-HP, Hôpital Saint Antoine, Parasitologie-Mycologie Service, Paris, Franța,

Dominique Mazier

1 Universitatea Pierre et Marie Curie-Paris6, UMR S945, Paris, Franța,

5 INSERM, U945, Paris, Franța,

6 AP-HP, Hôpital Saint Antoine, Parasitologie-Mycologie Service, Paris, Franța,

Cécile Fairhead

3 Université Paris-Sud 11, Institut de Génétique et Microbiologie și CNRS UMR 8621, Orsay, Franța,

Christophe Hennequin

1 Universitatea Pierre et Marie Curie-Paris6, UMR S945, Paris, Franța,

5 INSERM, U945, Paris, Franța,

6 AP-HP, Hôpital Saint Antoine, Parasitologie-Mycologie Service, Paris, Franța,

Conceput și proiectat experimentele: DM CF CH. Au efectuat experimentele: RA AA MT. Analiza datelor: FG JG. Am scris lucrarea: RA CF CH.

Date asociate

Abstract

Aderența la mucoasa digestivă este considerată un prim pas crucial în patogenitatea infecțiilor invazive cu Candida. Infecțiile diseminate cu Candida glabrata încep predominant din intestin. A fost creat un model de șoarece de infecție diseminată începând de la intestin. Diseminarea hematogenă a fost obținută după o dietă cu conținut scăzut de proteine, urmată de un regim de ciclofosfamidă-metotrexat și o inoculare orală a drojdiilor prin apa potabilă. Ficatul a fost primul organ infectat (ziua 7 postinfecție), iar letalitatea a fost de 100% în ziua 21 postinfecție. Acest nou model de șoarece a fost utilizat pentru a compara rata mortalității și sarcina fungică în organele profunde induse de 5 tulpini care prezintă niveluri diferite de aderență la celulele enterocite Caco-2, așa cum s-a determinat într-un test pe tulpini de 36 C. glabrata. În acest model, nu a fost demonstrată nicio diferență statistică de letalitate între tulpini, iar sarcina fungică a variat la rinichi și plămâni, dar fără corelație cu nivelul de aderență la enterocite. Studiile ulterioare care utilizează modelul dezvoltat aici permit analiza traversării mucoasei digestive de către drojdii și ajută la relaționarea acestui lucru cu fenotipurile de adeziune încă slab înțelese.

Introducere

Candidoza invazivă reprezintă infecții oportuniste care pun viața în pericol, a căror incidență a crescut dramatic în anii 1980 [1]. În timp ce Candida albicans rămâne principala cauză a acestor infecții, Candida glabrata a apărut în mod semnificativ și acum ocupă în mod regulat numărul doi printre agenții etiologici ai diferitelor forme clinice de candidoză [2], [3]. C. glabrata reprezintă o problemă terapeutică gravă datorită rezistenței sale naturale la derivații azolici și, probabil, din cauza întârzierii inițierii adecvate a terapiei, unele rapoarte au descris rate mai mari de mortalitate pentru infecțiile cu C. glabrata decât cu C. albicans [4].

Astfel, în această lucrare, am dorit mai întâi să stabilim un model de șoarece de infecție diseminată de C. glabrata pornind de la intestin, care poate fi utilizat în continuare pentru a analiza mecanismele care predispun la traversarea barierei digestive a mucoasei de către C. glabrata. . Odată validat, acest model a fost folosit pentru a provoca șoarecii cu tulpini clinice aparținând aceluiași complex clonal și caracterizat anterior pentru a avea fie un nivel de aderență scăzut, fie ridicat, așa cum a fost testat pe linia celulară de enterocite Caco-2.

Materiale și metode

Tulpini

În acest studiu a fost utilizat un grup de 36 de tulpini clinice C. glabrata, plus tulpina de referință ATCC2001 (CBS138). Genotipul lor și clasificarea grupului clonal au fost determinate anterior folosind o metodă moleculară bazată pe analiza polimorfismului de lungime al regiunilor care conțin microsateliți [13], [14]. Tipul de împerechere a fiecăreia dintre aceste tulpini a fost, de asemenea, determinat anterior folosind o combinație de primeri specifici. Pentru acest studiu, tulpinile au fost selectate astfel încât să reprezinte în cel mai bun caz diversitatea genotipică a speciei (adică aparținând diferitelor complexe clonale din studiile menționate mai sus). O subcultură monoclonală a fiecărei tulpini a fost depozitată la -80 ° C. Pentru experimente, culturile stoc au fost placate pe 1% extract de drojdie 1% peptonă-2% agar glucoză (YPD) și apoi incubate la 37 ° C timp de 24 de ore.

Modelul murin al candidozei diseminate hematogene

Studiul a fost realizat în conformitate cu legislația europeană care acoperă utilizarea animalelor în scopuri științifice. Protocolul a fost aprobat de comitetul instituțional local de îngrijire și utilizare a animalelor al Facultății de Medicină Pitié-Salpêtrière.

Aderența enterocitelor

Testele de aderență au fost efectuate folosind linia celulară Caco-2, derivată dintr-un carcinom colorectal [15]. Celulele au fost cultivate pe lamele de sticlă cu diametrul de 11 mm, plasate în vase de plastic cu 24 de godeuri. Celulele au fost lăsate să se diferențieze în monostraturi timp de 16-21 de zile la 37 ° C cu 5% CO2. Celulele au fost spălate și infectate cu 1057 fază de creștere staționară C. celule glabrata suspendate în 500 de l de soluție salină tamponată cu fosfat preîncălzit (PBS). După o perioadă de incubație de 30 min la 37 ° C, celulele au fost spălate ușor de trei ori pentru a îndepărta drojdiile neaderente. Celulele Caco-2 cu drojdii aderente au fost apoi răzuite și colectate în 500 pl de PBS. Diluțiile seriale au fost plasate pe mediu YPD și incubate timp de 48 de ore la 37 ° C. Unitățile de formare a coloniilor (CFU) au fost numărate și utilizate pentru a calcula rata de aderență ca raport al CFU-urilor împărțit la numărul de celule inoculate (10 7). Pentru a limita impactul variabilității între teste, rata de aderență a unei tulpini date a fost împărțită la rata de aderență a tulpinii de referință ATCC2001 testate în același experiment. Fiecare izolat a fost testat în duplicat și s-au efectuat două experimente separate (patru seturi de date colectate).

Analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind GraphPad Prism vs 5.0 (software GraphPad). Medianele măsurilor repetate de aderență la celulele Caco-2 au fost comparate între tulpini folosind testul Kruskal-Wallis urmat de post-testul lui Dunn pentru fiecare pereche de tulpini. În mod similar, comparațiile între complexele clonale și între tipul de împerechere au fost realizate folosind testul sumelor de rang Kruskal-Wallis (scară cantitativă). Compararea curbelor de supraviețuire a fost făcută folosind testul Mantel-Cox log rank. Sarcina fungică în organe, determinată de numărul de CFU per g, a fost analizată cu testul non-parametric al lui Mann-Whitney atunci când au fost comparate două grupuri și cu testul ne-parametric al lui Kruskal-Wallis pentru mai mult de două grupuri. Perechi de grupuri au fost comparate în continuare cu testul lui Dunn. O valoare P mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă.

Rezultate

Dezvoltarea unui model de șoarece de candidoză hematogenă cu intestinul ca punct de plecare

Pentru a imita cel mai bine diseminarea hematogenă a C. glabrata pornind de la intestin, am dezvoltat un model de șoarece cu inoculare orală de drojdii, folosind tulpina de tip ATCC2001. Înainte de infecție, șoarecii erau hrăniți cu o dietă cu conținut scăzut de proteine, un factor predispozant care anterior s-a arătat că subțiază mucoasa intestinului subțire și a colonului, favorizând colonizarea Candida [16]. Neutropenia a fost indusă în continuare de un regim de chimioterapie citotoxică.

model

Șoarecii DBA2/J femele în vârstă de cinci săptămâni sunt infectați cu 5 × 107 CFU/ml în apă de băut timp de cinci zile după 14 zile de dietă săracă în proteine ​​și 24 de ore de foame. Un protocol de chimioterapie care include o singură injecție ip MTX și o injecție de CPA/zi timp de cinci zile consecutive urmează infecției. Șoarecii au la dispoziție apă sterilă alimentată cu enrofloxacină de la începutul chimioterapiei până la sfârșitul experimentului. MTX: metotrexat, CPA: ciclofosfamidă.

După sacrificarea unui animal din fiecare grup în diferite momente de timp după infecție, organele au fost îndepărtate aseptic și omogenizate pentru numărul de CFU (n = 3/zi).