Nhi Thao Ngoc Le

1 Institutul de Știință a Materialelor Aplicate, Academia de Știință și Tehnologie din Vietnam, Ho Chi Minh 70000, Vietnam; moc.liamg@ihncognoahtel (N.T.N.L.); moc.liamg@3112neyugnmota (Q.L.N.); moc.oohay@512reniknahirt (M.-T.N.-L.)

Ngoc Thuy Trang Le

2 Institutul de Cercetare și Dezvoltare, Universitatea Duy Tan, Danang 550000, Vietnam; nv.ude.natyud@4gnartyuhtnel

Quang Lam Nguyen

1 Institutul de Știință a Materialelor Aplicate, Academia de Știință și Tehnologie din Vietnam, Ho Chi Minh 70000, Vietnam; moc.liamg@ihncognoahtel (N.T.N.L.); moc.liamg@3112neyugnmota (Q.L.N.); moc.oohay@512reniknahirt (M.-T.N.-L.)

Truc Le-Buu Pham

3 Centrul de biotehnologie din orașul Ho Chi Minh, Ho Chi Minh 70000, Vietnam; nv.moc.hcetoibmch@curtuub

Minh-Tri Nguyen-Le

1 Institutul de Știință a Materialelor Aplicate, Academia de Știință și Tehnologie din Vietnam, Ho Chi Minh 70000, Vietnam; moc.liamg@ihncognoahtel (N.T.N.L.); moc.liamg@3112neyugnmota (Q.L.N.); moc.oohay@512reniknahirt (M.-T.N.-L.)

Dai Hai Nguyen

1 Institutul de Știință a Materialelor Aplicate, Academia de Știință și Tehnologie din Vietnam, Ho Chi Minh 70000, Vietnam; moc.liamg@ihncognoahtel (N.T.N.L.); moc.liamg@3112neyugnmota (Q.L.N.); moc.oohay@512reniknahirt (M.-T.N.-L.)

4 Universitate absolventă de știință și tehnologie, Academia de știință și tehnologie din Vietnam, Hanoi 100000, Vietnam

Abstract

1. Introducere

Având în vedere reducerea costurilor și a riscurilor clinice asociate cu tratamentele osoase, prezentul studiu oferă un proces sintetic într-un singur pas al α-HH din dihidrat. A-HH sintetizat a fost obținut la nivelul chirurgical și a minimizat riscurile potențiale ale aditivilor. Pentru informații suplimentare despre proprietățile biologice, a fost efectuată și evaluarea preliminară în fluidul corporal simulat (SBF). A fost utilizată o analiză de citotoxicitate pentru a investiga efectele toxice potențiale ale α-HH, în special sub formă de particule de sulfat de calciu, care pot exista clinic la pacienți.

2. Materiale și metode

2.1. Procesul de deshidratare în Hemihidrat în producție

Pudra de sulfat de calciu dihidrat (98%; Acros Organics - Thermo Fisher Scientific Inc., Morris Plains, NJ, SUA) a fost utilizată ca precursor în acest studiu. În primul rând, s-au adăugat 5 g CaSO4 · 2H2O într-o sticlă de laborator din sticlă conținând 200 ml de apă distilată și s-a agitat la o viteză de 600 rpm timp de 15 min. Apoi, a fost adus în condiții sintetice la 140 ° C și o presiune de 2,7 MPa timp de 4 ore într-o autoclavă. După terminarea reacției, suspensia a fost imediat filtrată și clătită de cinci ori cu apă distilată clocotită. În cele din urmă, a fost folosită o etapă de spălare cu acetonă pentru a îndepărta apa, urmată de uscare la 55 ° C, timp de 16 ore, pentru a îndepărta acetonă. Pulberea sintetizată a fost păstrată într-un recipient din sticlă întunecată la temperatura camerei pentru studiu.

2.2. Proces de hidratare în dihidrat în utilizare

Pulberea sintetizată a fost amestecată cu apă deionizată cu un raport lichid la pulbere (L/P) de 0,8 ml/g. Amestecul a fost agitat pentru a forma o pastă omogenă, apoi, injectat în matrițe din polistiren (14 mm diametru × 4 mm grosime) și depozitat la 65% umiditate la 37 ° C timp de 24 de ore. Probele formate în formă de disc, corespunzătoare formei utilizabile de α-HH, cunoscute și sub numele de cimenturi de sulfat de calciu, au fost caracterizate și evaluate pentru bioproprietăți.

2.3. Evaluarea preliminară in vitro în SBF

Lichidul corporal simulat (SBF) este o soluție anorganică cu concentrații de ioni similare cu plasma sanguină umană. Soluția SBF a fost, până în prezent, cea mai bună soluție pentru a verifica bioactivitatea osoasă in vitro prin capacitatea de formare a apatite a suprafețelor implantului destinate să vină în contact osos direct [23,24]. Apatitul este similar din punct de vedere chimic cu principala componentă anorganică a țesutului osos al mamiferelor. Este unul dintre puținele materiale care este clasificat ca material bioactiv, ceea ce înseamnă că sprijină creșterea osoasă și osteointegrarea atunci când este implantat într-un corp viu [25]. Creșterea activității biologice duce la formarea apatitei pe suprafața materialului într-un timp mai scurt.

Soluția SBF tamponată cu Tris-HCl de 27 mM HCO 3− (și anume Tris-SBF-27), utilizată în acest studiu, a fost formulată pe baza specificației Kukobo [24] cu modificări din A. Cuneyt Tas și colab. [26] pentru a se potrivi mai bine cu concentrațiile de ioni din plasma umană. Toți reactivii chimici au fost reactivi analitici (AR) și au fost utilizați direct fără nicio purificare. Materialele au fost monitorizate pentru diferite perioade de imersie în soluție (1, 3, 5, 7 și 10 zile). Raportul dintre suprafața totală și volumul soluției Tris - SBF-27 a fost de 10 mm 2 mL -1 la pH 7,4 și 37 ° C pentru fiecare probă în formă de disc. Soluția a fost reîmprospătată la fiecare 24 de ore pentru a asigura o compoziție chimică inițială constantă [27]. Valoarea pH-ului soluției a fost măsurată zilnic pentru un grup de probe fără reîmprospătare. După timpul de înmuiere preselectat, probele au fost spălate ușor cu apă deionizată pentru a îndepărta soluția SBF urmată de uscare cu aer într-un desicator. Apoi, masa uscată a fost cântărită pentru a calcula schimbarea înainte și după imersiunea în soluția SBF. Degradarea a fost calculată în termeni procentuali prin pierderea în greutate pe greutatea sa inițială.

2.4. Caracterizare materială

Imaginile morfologice ale probelor au fost luate cu microscopie electronică de scanare (SEM) (S-4800; Hitachi Ltd., Tokyo, Japonia) și dimensionate utilizând software-ul ImageJ (ImageJ; versiunea 1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA ). Analiza cristalinității și identificarea fazelor au fost efectuate prin spectru infraroșu (FTIR) (spectrometru Frontier FTIR/NIR; PerkinElmer Inc., Waltham, MA, SUA) în intervalul de undă de 4000-400 cm -1 folosind metoda peletelor KBr și X- difracție de raze (XRD) (Diffractometru cu raze X D8 Advance-Bruker; Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Germania) cu radiație Cu Kα (λ = 1.54178Å), la o rată de scanare de 5 °/min în intervalul 2θ de la 5 ° până la 70 °. Analiza termogravimetrică (TGA) a fost efectuată pentru a determina puritatea fazelor utilizând un sistem de analiză termică (TGA-DSC 3+; Mettler Toledo Inc., Columbus, OH, SUA) de la 0-300 ° C la o rată de încălzire de 10 ° C/min în aer.

2.5. Test de citotoxicitate al lactatului dehidrogenază (LDH)

În prezentul studiu, testul de citotoxicitate LDH a fost realizat în contact direct între celule și particulele CS pentru evaluarea expunerii pe termen scurt. Linia de celule fibroblastice embrionare de șoarece (NIH 3T3; Centrul de Biotehnologie din Ho Chi Minh City, Ho Chi Minh City, Vietnam) a fost cultivată în mediul Eagle modificat (DMEM) al lui Dulbecco (Gibco - Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SUA) . Pulberea sintetizată a fost cântărită la 10, 25, 50, 100 și 200 mg. Aceste probe au fost apoi sterilizate cu radiații ultraviolete timp de 2 ore. Probele sterilizate au fost înmuiate în 1 ml mediu de cultură celulară timp de 1 oră de sonicare pentru a obține soluții de probă. Suspensiile de celule NIH 3T3 cu 1 × 105 celule/godeu la 100 uL au fost însămânțate în fiecare godeu și incubate în condiții de cultură celulară timp de 24 de ore pentru a forma un monostrat semi-confluent. Ulterior, mediile de cultură celulară au fost înlocuite cu 100 uL de soluții de probă (n = 7). Citotoxicitatea după incubare timp de 24 de ore a fost determinată utilizând kitul de testare a citotoxicității LDH-WST (Dojindo Molecular Technologies Inc., Kumamoto, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. După incubare timp de 4 ore, s-au format cristale de formazan.

Integritatea membranei a fost vizualizată pe baza scindării unei sări de tetrazoliu (WST) la formazan de culoare roșie de către lactatul dehidrogenază intracelulară (LDH) eliberat în celulele vii. Viabilitatea celulei a crescut proporțional cu cantitatea de formazan format, care a fost înregistrată de valoarea densității optice (OD) la 450 nm folosind un cititor de microplăci (VersaMax ™ Microplate Reader; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, SUA). Procentul de viabilitate a fost calculat din valoarea DO folosind următoarea ecuație:

unde DO este valoarea medie a DO măsurată a probelor testate; ODn este valoarea medie a DO măsurată a probelor de control negativ; și ODb este valoarea medie a DO măsurată a probelor martor. Eșantionul este considerat a avea potențial citotoxic acut atunci când valoarea viabilității scade sub 70%.

2.6. Analize statistice

Seturile de date au fost procesate utilizând software-ul Microsoft Excel 2019 și au fost exprimate ca medie ± deviație standard. Valorile medii experimentale au fost comparate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) utilizând software-ul Minitab (Minitab ®; versiunea 16.0, Minitab LLC, State College, PA, SUA) cu testul Tukey pentru comparație între grupuri. În toate evaluările, p Figura 1) prezintă absorbanțele componentelor cristaline din pulberea sintetizată. Vârfurile principale corespunzătoare hemihidratului reprezentate la 660 cm -1 pentru vibrațiile de îndoire a ionului SO4 2−, 3560 și 3610 cm -1 pentru valența O - H (întindere) și 1620 cm -1 pentru vibrațiile de îndoire ale unui singur tip de apă în structura moleculară [28,29]. Celelalte vârfuri indicau vibrații ale ionului sulfat, inclusiv 600 cm -1 (îndoire), 1008 cm -1 (întindere), 1096 cm -1 (întindere), 1115 cm -1 (întindere) și 1152 cm -1 (întindere). Nu a existat prezența unor grupuri funcționale străine în cristale care să arate că acetonă în etapa de spălare a fost îndepărtată efectiv.

evaluări

Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR) a pulberii sintetizate.

Modelul XRD (Figura 2) confirmă în continuare formarea fazelor de sulfat de calciu prin vârfurile lor tipice. Cele mai multe vârfuri au fost indexate corespunzător HH standard (ICDD 41-0224). Trei vârfuri corespunzătoare DH standard (ICDD 33-0311) au fost, de asemenea, detectate la un semnal scăzut. Rezultatele au arătat că HH a fost aproape singurul mineral din pulberea sintetizată, dar au existat încă urme de DH. XRD a fost încă incapabil să verifice dacă hemihidratul aparținea formei a sau formei β. Cu toate acestea, Surajit M. și colab. a subliniat din modelele standard ale fazelor CS că β-HH ar avea vârfuri de difracție de intensitate mare și mică [30]. În plus, vârful α-HH la planul (204) ar fi remarcabil mai mic decât planul (400). Prezenta sinteză utilizând o autoclavă a dus la formarea de cristale foarte cristaline, spre deosebire de β-HH și planuri de cristal compatibile cu α-HH. În consecință, sulfatul de calciu hemihidrat sintetizat era de așteptat să aibă forma α.

Model de difracție cu raze X (XRD) a pulberii sintetizate.

Figura 3 prezintă modificările morfologice înainte și după tratamentul de deshidratare. Din micrografii, precursorul dihidrat cu forme variate (Figura 3 a) a fost transformat în cristale hemihidrate care au o morfologie omogenă de formă prismatică cu margini ascuțite (Figura 3 b). Este larg acceptat faptul că cristalele α-HH sunt caracterizate de cristale idiomorfe transparente bine formate, cu margini ascuțite ale cristalelor, în timp ce β-HH constă din particule fulgioase formate din cristale mici [10,15,31]. Prin urmare, combinat cu rezultatele XRD din Figura 2, se poate concluziona cu tărie că hemihidratul as-sintetizat a fost atribuit formei α. Măsurătorile de dimensiune au dat o lungime medie a cristalului de 20,96 ± 8,83 µm și un diametru de 1,30 ± 0,71 µm.

Micrografii cu microscopie electronică cu scanare (SEM) a micrografiilorA) Precursor dihidrat (DH) șib) pulberea sintetizată.

Figura 4 prezintă pierderea în greutate (%) a produsului sintetizat măsurată prin TGA. Teoretic, conținutul de apă cristalină de HH și DH este de 6,2%, respectiv 20,9%. Pornind de la o temperatură ambiantă, curba a arătat că pulberea a pierdut treptat o cantitate mică de masă prin apa fizizorbită. Pierderea rapidă de masă datorată deshidratării (la aproximativ 100 ° C) a probei a fost înregistrată la 6,4026%, ceea ce este mai mare decât procentul de apă conform teoriei HH [32,33]. Prin urmare, analiza fazei în TGA a fost compatibilă cu rezultatele XRD din Figura 2, indicând faptul că HH și DH au fost ambele incluse. Calculând din pierderea în greutate înregistrată, puritatea α-HH a fost estimată la 98,62%. În consecință, odată cu minimizarea chimică în producție, α-HH a atins suficient gradul chirurgical în standardul FDA pentru ca puritatea (CaSO4 ≥ 98% în masă) să fie aplicată ca materiale osoase [21].

Curba de termogravimetrie a pulberii sintetizate.