Evgeniya N. Andreyeva

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

instrumente

Anna A. Ogienko

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

2 Universitatea de Stat Novosibirsk, Novosibirsk, 630090 Rusia

Tatiana D. Dubatolova

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

Anastasiya L. Oshchepkova

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

3 Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

Elena N. Kozhevnikova

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

Anton V. Ivankin

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

Gera A. Pavlova

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

Serghei A. Kopyl

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

Alexey V. Pindyurin

1 Institutul de biologie moleculară și celulară, filiala siberiană a Academiei de Științe din Rusia, Novosibirsk, 630090 Rusia

2 Universitatea de Stat Novosibirsk, Novosibirsk, 630090 Rusia

Conferinţă

Date asociate

Toate datele de sprijin sunt incluse în fișierele suplimentare. Materialele generate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorii relevanți la cerere rezonabilă.

Abstract

fundal

Expresia genei CNDP2 este frecvent reglată în sus sau în jos în diferite tipuri de cancer uman. Cu toate acestea, modul în care produsul acestei gene este implicat în creșterea și proliferarea celulelor este puțin înțeles. Mai mult, cunoștințele noastre despre funcțiile ortologilor CNDP2 în organisme model bine stabilite sunt rare. În special, funcția ortologului D. melanogaster al CNDP2, codificată de gena CG17337 (denumită în continuare dCNDP2), este încă necunoscută.

Rezultate

Acest studiu a avut ca scop dezvoltarea unui set de instrumente genetice și moleculare pentru a studia rolurile dCNDP2. Am generat o mutație nulă dCNDP2 (denumită în continuare ∆dCNDP2) utilizând recombinarea omologă (HR) mediată de CRISPR/Cas9 și am constatat că mutanții ∆dCNDP2 sunt homozigoti viabili, morfologic normali și fertili. De asemenea, am generat linii de zbor transgenice care exprimă proteina dCNDP2 marcată eGFP și nemarcată, toate sub controlul promotorului UAS, precum și anticorpi policlonali specifici dCNDP2. Folosind aceste instrumente, demonstrăm că doar una dintre cele două izoforme dCNDP2 prezise este exprimată în diferite țesuturi testate. dCNDP2 a fost detectat atât în ​​citoplasmă, cât și în nucleu și s-a dovedit a fi asociat cu mai multe situri din cromozomii politeni ai glandei salivare.

Concluzii

Gena dCNDP2 nu este esențială pentru viabilitatea zborului în condiții standard de laborator. Modelul de localizare subcelulară a dCNDP2 sugerează că această proteină ar putea avea roluri atât în ​​citoplasmă, cât și în nucleu. Instrumentele genetice și moleculare dezvoltate în acest studiu vor permite caracterizarea funcțională suplimentară a proteinei CNDP2 conservate utilizând D. melanogaster ca sistem model.

Material suplimentar electronic

Versiunea online a acestui articol (10.1186/s12863-019-0726-z) conține materiale suplimentare, care sunt disponibile utilizatorilor autorizați.

fundal

Peptidazele cu specificități diferite ale substratului joacă roluri distincte în metabolismul proteinelor și peptidelor în eucariote. CNDP2 de mamifere (cunoscută și sub numele de carnozin dipeptidază II, CN2, carboxipeptidază asemănătoare glutamatului, CPGL) aparține familiei M20 a metalopeptidazelor și are o specificitate largă a substratului pentru dipeptide [1, 2]. Este activ doar ca homodimer [3], iar domeniul catalitic al fiecărei subunități dimerice are un centru activ cu doi ioni Mn 2+ sau Zn 2+, care determină specificitatea enzimei pentru substraturile sale fiziologice [4]. Până în prezent, CNDP2 este singura protează cunoscută care poate cataliza formarea pseudodipeptidelor de acid lactic și aminoacizi (N-lactoil-aminoacizi) prin proteoliză inversă in vivo [5]. Astfel, pe lângă activitatea proteolitică, CNDP2 ar putea îndeplini și alte funcții celulare.

O expresie aberantă a CNDP2 este asociată cu tumorigeneză la om. Un nivel scăzut de CNDP2 a fost observat în cancerul pancreatic, carcinomul hepatocelular și cancerul gastric [2, 6, 7]. Izoforma CNDP2, CPGL-B, căreia îi lipsește o parte din domeniul catalitic, a fost implicată și în suprimarea tumorii, dar în prezent nu se știe dacă CPGL-B are activitate peptidazică [2, 6, 7]. Cu toate acestea, nu toate tumorile sunt caracterizate de niveluri scăzute de CNDP2. O expresie reglată în sus a CNDP2 a fost într-adevăr observată în carcinomul mamar și în cancerele de rinichi și colon [8-11]. Mai multe studii au fost dedicate înțelegerii contribuției CNDP2 la carcinogeneză [2, 6-11], dar un model animal cu CNDP2 mutant nu este disponibil în prezent.

Proteina CNDP2 este extrem de conservată în toate speciile [1, 12-14] și exprimată în mod omniprezent ([1]; O bază de date a genelor și genomilor Drosophila disponibilă de pe flybase.org [15]). În celulele umane și de șoarece, CNDP2 se localizează în citosol și nucleoplasmă (Atlasul Proteinelor Umane disponibil de pe www.proteinatlas.org [16]); în celulele ovarului de hamster chinez (CHO) transfectat tranzitoriu, CNDP2 a fost găsit în fracția citoplasmatică [1]. În D. melanogaster, există o singură genă CNDP2 (CG17337; flybase.org [15]), denumită în continuare dCNDP2. Alinierea secvențelor de aminoacizi a celei mai lungi izoforme a CNDP2 uman (475 aminoacizi; Nr. Acces GenPept> NP_060705.2) și cea mai lungă izoformă a Drosophila dCNDP2 (478 aminoacizi; Nr. Acces GenPept> NP_610181.2) a relevat 63 % identitate secvență pe toată lungimea polipeptidei. Dintre puținele gene D. melanogaster care codifică proteinele metalopeptidazei M20, numai dCNDP2 este exprimat omniprezent cu nivel moderat până la nivel ridicat (flybase.org [15]). Produsul acestei gene s-a dovedit a fi o componentă extracelulară a hemolimfei larvare [17, 18], dar localizarea sa subcelulară este necunoscută.

Pentru a aborda rolul CNDP2 în creșterea și proliferarea celulelor, am decis să exploatăm D. melanogaster ca sistem model. Ușurința manipulărilor genomice la muște permite investigarea proceselor atât la nivel organic, cât și celular. În acest studiu, am generat un mutant nul dCNDP2, linii transgenice pentru expresia inductibilă a dCNDP2, anticorpi policlonali împotriva dCNDP2 și am folosit aceste instrumente pentru a furniza o caracterizare inițială a proteinei.

Metode

Stocuri de zbor

Muștele au fost ridicate și încrucișate la 25 ° C conform procedurilor standard. Au fost utilizate următoarele linii de la Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN; bdsc.indiana.edu): # 1824 (y 1 w *; P + mW.hs = GawB> AB1); # 32186 (w *; P + t7.7 w + mC = 10xUAS-IVS-mCD8: GFP> attP40); # 4775 (w 1118; P + mC = UAS-GFP.nls> 14); # 24488 (y 1 MZH-2A w *; MZH-102D); # 51325 (w 1118; PBac + mDint2 = vas-Cas9, U6-tracrRNA> VK00027) și # 6599 (y 1 w 67c23) ca control de tip sălbatic. Stocul care transportă transgenul nanos-Cre [19] și linia PattP154 [20] au fost furnizate cu amabilitate de Stepan N. Belyakin și respectiv de Sergei A. Demakov (IMCB SB RAS, Novosibirsk, Rusia).

Constructe plasmidice

Secvențe de ARN-ghid de douăzeci de nucleotide (gARN) pentru gena dCNDP2, gARN1 (5′-GUAAAUAGAUUCGACGUAA-3 ′) și gARNNA2 (5′-GAACCAGAUAUGACCCGCGA-3 ′), au fost proiectate folosind instrumentul de proiectare CRISPR (resurse de proiectare zlab). Secvențele lor de ADN corespunzătoare au fost clonate în vectorul plasmidei pU6-BbsI-chiRNA [21] în aval de promotorul Drosophila U6 prin utilizarea siturilor de restricție BbsI pentru a produce construcții pU6-5′dCNDP2-chiRNA și pU6-3′dCNDP2-chiRNA. Fiecare plasmidă exprimă ARN himeric (chiARN) compus din tracrARN de la Streptococcus pyogenes cu secvența specifică de 20-nt gARN la capătul 5 '[21]. Vectorul plasmidic pU6-BbsI-chiRNA a fost un cadou de la Melissa Harrison și Kate O'Connor-Giles și Jill Wildonger (Plasmida Addgene # 45946).

Construcția plasmidică pGX-5 '& 3'-dCNDP2-nul conținând o casetă de reporter „amplificator GMR-mini-albă genă” plasată între două fragmente de ADN, care flancează gena dCNDP2 din genomul D. melanogaster și denumită aici 5 ′ - și brațele de omologie 3 ′ (sau pur și simplu brațele stânga și dreapta), au fost realizate după cum urmează. În primul rând, brațul stâng (2R: 5.695.002-5.696.806; aici și după aceea, coordonatele provin din versiunea 6 a ansamblului genomului D. melanogaster [22]) a fost clonat în vectorul plasmidei pGX-attP [23] folosind NotI și KpnI unice site-uri. Aceasta a condus la plasmida intermediară pGX-5'-dCNDP2-nulă. Apoi, brațul drept (2R: 5,701,122-5,703,566) a fost clonat în pGX-5'-dCNDP2-plasmidă nulă utilizând site-urile unice AscI și XhoI pentru a produce construcția nulă pGX-5 '& 3'-dCNDP2. Brațul drept clonat conține următoarele trei variații de nucleotide unice, toate în amonte de locul de pornire a transcripției genei vlc: 5.701.650 T> C, 5.701.704_5.701.705insA și 5.701.862 T> C. Vectorul plasmidic pGX-attP [23] a fost furnizat cu amabilitate de Sergei A. Demakov (IMCB SB RAS, Novosibirsk, Rusia).

Pentru a realiza o construcție de salvare pGE-attB-GMR-dCNDP2, am clonat un fragment de ADN genomic de 4,3 kb care poartă gena dCNDP2 (2R: 5.696.807–5.701.121) în vectorul plasmidei pGE-attB-GMR [23] folosind unicul NheI și Site-uri AscI. Fragmentul de ADN clonat conține următoarele opt variații ale nucleotidelor în interiorul și în apropierea genei dCNDP2: 5.697.584C> T (în amonte de locul inițial de transcriere distală), 5.698.421 T> A, 5.699.251 T> G, 5.699.713G> T, 5.699.725del ( în regiunile intronice), 5.699.463G> A (substituție sinonimă), 5.700.144 T> A (în regiunea netradusă 3 ′) și 5.700.278 T> C (în aval de locul de terminare a transcripției). Vectorul plasmidic pGE-attB-GMR [23] a fost furnizat cu amabilitate de Sergei A. Demakov (IMCB SB RAS, Novosibirsk, Rusia).

Pentru a genera o construcție pUASTattB-dCNDP2 pentru expresia ectopică a proteinei dCNDP2, am mai întâi amplificat PCR secvența ADN (corespunzătoare nucleotidelor 100-1536 din numărul de acces GenBank> NM_136337.3, dar cu 1023G> A și 1154A> T nucleotidă substituții) care codifică izoforma mai lungă a dCNDP2 (478 aminoacizi; în continuare dCNDP2-A). Ca șablon, am folosit un ADNc sintetizat din ARN total izolat de la 0 la 24 de h embrioni din tulpina Canton-S de tip sălbatic. Apoi, fragmentul de ADN amplificat a fost donat în vectorul plasmidei pUASTattB [24] utilizând site-urile unice EcoRI și XbaI.

Pentru a face construcții pUASTattB-eGFP-dCNDP2 și pUASTattB-dCNDP2-eGFP pentru expresia ectopică a proteinelor de fuziune dCNDP2 etichetate cu N-și C-terminale eGFP, am folosit secvența de codare dCNDP2-A de lungime completă (vezi mai sus). Acesta a fost fuzionat în cadru, fie în aval, fie în amonte de secvența de codificare eGFP, utilizând mutageneză dirijată de sit prin extensie de suprapunere [25]. Fragmentele de ADN au fost apoi clonate în vectorul plasmidei pUASTattB [24] folosind site-urile unice EcoRI și XbaI și respectiv site-urile EcoRI și KpnI.

Pentru a produce constructul pGEX-4 T-dCNDP2, secvența de codare dCNDP2-A de lungime completă (vezi mai sus) a fost clonată în cadru în vectorul de plasmidă pGEX-4 T-1 (GE Healthcare) în aval de glutation S-transferază (GST) secvență de codare utilizând site-urile BamHI și XhoI.

Toate construcțiile plasmidice au fost verificate prin secvențierea ADN-ului. Detalii despre construcțiile plasmidei sunt disponibile la cerere.

Editare și transgeneză a genomului liniei germinale

Pentru a genera o alelă nulă a dCNDP2, pU6-5′dCNDP2-chiRNA și pU6-3′dCNDP2-chiRNA care vizează constructele și donatorul pGX-5 ′ & 3′-dCNDP2-nul construit, toate dizolvate în apă, au fost amestecate cu concentrații finale de 125 ng/μl, 125 ng/μl și respectiv 500 ng/μl. Amestecul a fost injectat în embrioni din w 1118; PBac + mDint2 = vas-Cas9, U6-tracrRNA> tulpină VK00027 (stoc Bloomington # 51325) conform procedurii standard descrisă anterior [26]. În total, au fost injectate 986 de embrioni, dintre care doar 191 (19,4%) s-au dezvoltat până la stadiul adult. Transformanții au fost identificați în descendenții G1 ai injectațiilor fertili prin fenotip w +. Am găsit doar un astfel de bărbat de muscă, indicând faptul că eficiența HR mediată de CRISPR/Cas9 la locusul dCNDP2 a fost de 0,1% (1/986). Plasmida pGE-attB-GMR-dCNDP2 a fost injectată la o concentrație de 300 ng/μl în embrioni ∆dCNDP2 care exprimă integraza phiC31 în linia germinativă [24]. Plasmidele pUASTattB-dCNDP2, pUASTattB-eGFP-dCNDP2 și pUASTattB-dCNDP2-eGFP au fost injectate individual la concentrația de 300 ng/μl în embrioni care transportă situl de aterizare attP154 [20] și exprimă integraza phiC31 în germen.

Extracția ADN genomic și genotiparea prin PCR a alelelor dCNDP2 proiectate

Pentru a izola ADN-ul genomic, s-au măcinat 3-5 muște în 200 μl tampon de extracție ADN (100 mM Tris-HCI [pH 7,5], 100 mM NaCl, 0,5% SDS, 50 mM EDTA [pH 8,0], 200 mM zaharoză) în un tub de 1,5 ml și proba a fost incubată la 65 ° C timp de 30 de minute. Apoi, s-au adăugat 300 pl de KAc 5 M, s-au amestecat bine prin inversare și proba a fost păstrată pe gheață timp de 30 de minute. Tubul a fost centrifugat timp de 15 minute la 14.000 rpm. Apoi, supernatantul a fost transferat într-un tub nou și ADN-ul a fost precipitat cu etanol. În cele din urmă, peleta a fost dizolvată în 10-50 μl de apă fără nuclează. PCR a fost efectuată utilizând ADN polimeraza Hot-Start Taq (Biolabmix, MH010) conform recomandărilor producătorului. Pentru genotiparea locusului dCNDP2 după fiecare etapă a modificării sale, s-au folosit perechi de primer specific alelei (Fișier suplimentar 1: Tabel S1). Produsele PCR au fost analizate pe gel de agaroză 1% împreună cu Scara GeneRuler 1 Kb Plus ADN (Thermo Scientific, SM1331).

Producția de anticorpi anti-dCNDP2

Proteina de fuziune GST-dCNDP2 a fost exprimată în tulpina Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Promega) și ulterior purificată așa cum s-a descris anterior [27]. Proteina de fuziune GST-dCNDP2 purificată a fost utilizată pentru imunizarea șoarecilor. Anticorpii policlonali au fost purificați din afinitate din ser, după cum sa raportat anterior [27].

Cultura celulelor S2 și interferența ARN (ARNi)

În primul rând, am selectat un fragment de genă 826-bp dCNDP2, care este prezent în ambele izoforme ale transcrierii genei, ca șablon pentru sinteza ARN-ului cu dublă catenă (dsRNA). Am amplificat fragmentul de ADN folosind primerii 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGcgagatcggtcg-3 'și 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGatagcgccacctgg-3' care conțin secvența promotorului polimerazei T7 la capetele lor 5 '(prezentate cu majuscule). Produsul PCR a fost purificat folosind kitul de purificare GeneJET PCR (Thermo Scientific, K0702) și apoi utilizat ca șablon pentru sintetizarea dsRNA așa cum s-a descris anterior [28], cu modificări minore. Tratamentul cu DNaseI s-a făcut după încălzirea dsRNA sintetizat la 65 ° C și răcirea sa lentă la temperatura camerei; în plus, s-a permis extracția fenolului/cloroformului.

Celulele S2 au fost lipsite de contaminarea cu micoplasma și au fost cultivate în scuturi de 39,4 g/L și mediu de insecte Sang M3 (Sigma, S8398) suplimentate cu 0,5 g/L KHCO3 și 20% ser fetal bovin fetal inactivat termic (FBS; Thermo Scientific, 10270106) la 25 ° C. Tratamentele cu ARNi au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [29], cu următoarele modificări. Douăzeci și cinci de μg de dsARN purificat au fost adăugate celulelor de trei ori (în prima, a treia și a cincea zi de incubație) și celulele au fost recoltate pentru analize după 7 zile de ARNi. Probele de celule S2 de control au fost preparate în același mod, dar fără adăugarea de ARNd.

Western blot

Colorarea prin imunofluorescență (IF)

Imunomarcarea celulelor S2 și a cromozomilor politeni glandei salivare zdrobite a fost efectuată așa cum sa descris anterior [31, 32]. Anticorpii policlonali primari policlonali α-dCNDP2 de șoarece au fost utilizați la o diluție de 1: 1000 și detectați de anticorpi IgG α-șoarece de capră conjugați cu Alexa Fluor 488 (1: 500; Invitrogen, A-11001). Imaginile IF ale celulelor S2 au fost realizate folosind microscopul confocal Zeiss LSM 710 și o lentilă apo de 100 ×/1,40 în ulei. Imaginile IF ale cromozomilor politenici au fost achiziționate cu un microscop cu fluorescență Zeiss Axio Observer.Z1 echipat cu o cameră mono (D) Axiocam 506 folosind un obiectiv apo ulei 63 ×/1,40. În ambele cazuri, software-ul ZEN 2012 a fost utilizat pentru achiziționarea imaginii.

Pentru detectarea proteinelor de fuziune dCNDP2 marcate cu eGFP, glandele salivare întregi au fost fixate în PBS conținând 4% formaldehidă (Merck, 104003), spălate de 3 ori timp de 5 minute fiecare cu PBS conținând 0,5% Triton X-100, colorate timp de 30 minute cu 0,4 μg/ml DAPI dizolvat în PBS și montat în 50% glicerol dizolvat în PBS. Imaginile IF ale glandelor montate în întregime au fost obținute pe un microscop confocal Zeiss LSM 710 folosind un obiectiv 20 ×/0,50 EC Plan-Neofluar. Secțiunile optice au fost combinate utilizând software-ul LSM Image Browser versiunea 3.5 (Zeiss).

Rezultate

Pentru a aborda funcția dCNDP2, am generat o mutație nulă în genă, ∆dCNDP2, folosind metoda HR dezvoltată recent CRISPR/Cas9 mediată HR [21], care este ilustrată în detaliu în Fig. 1 și în fișierul suplimentar 2: Figura S1. Produsul final al acestei proceduri a fost mutația nulă ∆dCNDP2 care poartă un sit phiC31 attP în loc de

Secvență de ADN de 4,3 kb care conține întreaga genă dCNDP2. Am constatat că mutanții homozigoti nu prezintă anomalii morfologice vizibile și sunt fertili. De asemenea, am folosit recombinarea mediată de integrază phiC31 pentru a livra același lucru

Fragment de ADN de 4,3 kb care a fost șters în ∆dCNDP2 înapoi în locația sa genomică originală și a generat alela ∆dCNDP2 (salvare) (Fig. (Fig.1; 1; Fișier suplimentar 2: Figura S1).