1 Universitatea din Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazilia

eliminarea

2 Universitatea de Stat din Western Paraná (UNIOESTE), Cascavel, PR, Brazilia

Abstract

1. Introducere

S-a propus că aportul scăzut sau ridicat de calorii de către mame și tați este asociat cu perturbarea homeostaziei glucoză-insulină la descendenții lor [1]. Șoarecii au fost menținuți la o dietă cu conținut scăzut de proteine ​​la începutul vieții și hrăniți cu o dietă de control, în timpul vârstei adulte, și au, de asemenea, o creștere de recuperare asociată cu intoleranța la glucoză [2]. Într-adevăr, îmbunătățirile economice din țările în curs de dezvoltare, în ultimele decenii, au plasat subiecții umani în condiții similare. La acești subiecți, aportul unei diete normale sau bogate în calorii la vârsta adultă, după o perioadă de restricție calorică la începutul vieții, crește riscul de a dezvolta boli metabolice [3, 4]. Aceste situații de mediu timpurii sunt cunoscute sub numele de răspuns adaptiv predictiv sau ipoteză de fenotip economisitoare, postulată de Hales și Barker în 1992 [1].

Am arătat că șoarecii hrăniți cu o dietă săracă în proteine ​​în adolescență, urmată de o dietă bogată în grăsimi în timpul maturității, dezvoltă intoleranță la glucoză, rezistență la insulină și secreție redusă de insulină, comparativ cu cei hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi pe tot parcursul perioadă experimentală [5]. Acest lucru indică faptul că programarea metabolică, indusă de malnutriție la începutul vieții, afectează homeostazia insulinei-glucozei într-o măsură mai mare decât obezitatea în sine. În plus, șoarecii subnutriți și obezi pot prezenta leziuni ale neuronilor hipotalamici, care controlează aportul și cheltuielile de energie [6]. Șoarecii intoleranți la glucoză, expuși la o dietă cu conținut scăzut de proteine ​​la începutul vieții și la o dietă de control la maturitate, prezintă, de asemenea, o activitate vagală crescută, sugerând participarea sistemului nervos parasimpatic la homeostazia glucozei [2].

Programarea metabolică poate fi explicată prin conceptul Originile dezvoltării sănătății și bolilor (DOHaD) care descrie prin mai multe studii modul în care factorii de mediu precoce, cum ar fi nutriția, care pot induce modificări fiziologice la fetali, neonatali, adolescenți și adulți, ducând la programului pentru consecințe postnatale pe termen lung [7-9].

Astfel, am căutat să explorăm efectul vagotomiei subdiafragmatice asupra sensibilității, secreției și degradării insulinei la șoarecii metabolici programați, indusă de o dietă cu conținut scăzut de proteine ​​la începutul vieții, urmată de expunerea la o dietă bogată în grăsimi la vârsta adultă.

2. Materiale și metode

2.1. Animale

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Campinas (UNICAMP) (număr de aprobare: 3379-1). Șoarecii C57Bl/6 masculi au fost obținuți de la UNICAMP și menținuți la 22 ± 1 ° C într-un ciclu de lumină întuneric de 12 ore. Șoarecii în vârstă de treizeci de zile au fost hrăniți cu o dietă normală de proteine ​​(14% proteine) (grup NP) sau o dietă cu conținut scăzut de proteine ​​(6% proteine) (grup LP) timp de 4 săptămâni. După aceea, șoarecii LP au fost distribuiți în trei grupe: LP, care a fost ținut cu o dietă săracă în proteine; LP + HF, care a început să primească o dietă bogată în grăsimi (35% grăsimi) în decurs de 8 săptămâni; și LP + HFvag, care a fost supus vagotomiei și, de asemenea, a început să primească o dietă bogată în grăsimi pe parcursul a 8 săptămâni. Compozițiile dietetice au fost descrise într-un studiu anterior [10].

2.2. Procedura de vagotomie subdiafragmatică

La 4 săptămâni după o dietă cu conținut scăzut de proteine, șoarecii LP + HF au fost supuși vagotomiei troncale subdiafragmatice (grup LP + HFvag) sau operației simulate (LP + HF). Pentru această procedură, șoarecii cu post de 12 ore au fost anesteziați cu un amestec de ketamină și xilazină (0,06 și 0,02 mg/g prin i.p., respectiv; Vetbrands®, Paulínia, SP, BRA). Ulterior, stomacul și esofagul au fost exteriorizate din cavitatea peritoneală și ambele, trunchiul vagal dorsal și subdiafragmatic, au fost separate de esofag și tăiate. Șoarecii operați de rușine au fost supuși acelorași proceduri, dar nervul vag a fost păstrat intact. La sfârșitul perioadei experimentale, pentru a confirma vagotomia subdiafragmatică, retenția alimentară stomacală de la toate grupurile de șoareci a fost evaluată prin raportul dintre greutatea stomacului pe greutatea corporală (BW), conform studiului anterior [11-13].

2.3. Test de toleranță intraperitoneală la glucoză și insulină

Pentru testul de toleranță la glucoză (ipGTT) intraperitoneal (ipGTT), șoarecii au fost postiti peste noapte (12 ore) și o probă de sânge bazală a fost recoltată din vârful cozii (t = 0 min). Șoarecii au primit o administrare ip de 2 g/kg glucoză (Labsynth, Sao Paulo, Brazilia) dizolvată în soluție salină (0,9% NaCl în greutate/vol) și s-au înregistrat probe de sânge suplimentare la 15, 30, 60 și 120 min. Glucoza a fost înregistrată folosind un glucometru portabil (Accu-Chek Performa II, Roche Diagnostics, Elveția). Pentru testul de toleranță la insulină ip (ipITT), șoarecii au fost posti timp de 2 ore și s-a administrat o sarcină de insulină ip (Humulin R, Eli Lilly, Indianapolis, SUA) (1 U/kg). Sângele a fost prelevat imediat înainte de injectarea insulinei (t = 0 min) și în momentele 3, 6, 9, 12, 15, 18 și 21 de minute prin snip coadă folosind un glucometru portabil. Rata de dispariție a glucozei (KITT) a fost calculat așa cum s-a descris anterior [14, 15].

2.4. Eliminarea insulinei

În timpul ipGTT, probele de sânge au fost colectate din vârful cozii, înainte de încărcarea glucozei (t = 0) și 15 și 60 de minute după administrarea glucozei și plasate în microtuburi care conțin heparină anticoagulantă. Tuburile au fost centrifugate la 1100

, 15 min, 4 ° C, iar plasma a fost colectată și depozitată la -80 ° C. Insulina și peptida C au fost măsurate prin Insulina de șobolan/șoarece sau peptida C 2 ELISA Kit (cat. EZRMI-13K și EZRMCP2-21K, EMD Millipore, SUA, resp.), Conform instrucțiunilor producătorului. Clearance-ul insulinei a fost evaluat prin raportul peptidă C: insulină, după cum s-a descris anterior [16].

2.5. Izolarea insulelor și GSIS

Insulele au fost izolate prin digestia colagenazei a pancreasului, așa cum este descris de Boschero și colab. 1995. Pentru incubații statice, grupuri de cinci insule au fost preincubate timp de 30 de minute la 37 ° C cu 500 μL de tampon Krebs (KBB) cu următoarea compoziție: 115 mM NaCI, 5 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 15 mM HEPES; suplimentat cu 5,6 mM glucoză și 3 g albumină serică bovină (BSA) pe litru; și echilibrat cu un amestec de 95% O2-5% CO2 pentru a obține pH 7,4. După aceea, acest mediu a fost înlocuit cu tampon proaspăt și insulele au fost incubate timp de 1 oră cu 1 mL de KBB conținând 5,6, 11,1 sau 16,7 mM glucoză. La sfârșitul perioadei de incubație, supernatantele au fost colectate și menținute la -20 ° C. Pentru conținutul de insulină din insulă, s-au colectat grupuri de cinci insule, s-au transferat în tuburi care conțin 1 ml apă deionizată și s-au omogenizat folosind un sonicator (Brinkmann Instruments, SUA). Insulina a fost măsurată prin RIA utilizând insulină umană marcată radioactiv cu 125 I ca trasor, insulină de șobolan ca standard (Crystal Chem Inc., SUA) și anticorp de insulină de șobolan (donat de Dr. Leclerq-Meyer, Universitatea Liberă din Bruxelles, Belgia). Metoda dextran cu cărbune a fost utilizată pentru a separa insulina liberă de insulina 125 I legată de anticorpi.

2.6. Western Blot
2.7. Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM, iar diferențele au fost considerate semnificative atunci când

. Comparațiile au fost efectuate folosind un ANOVA unidirecțional, urmat de testul lui Tukey. Testele au fost efectuate folosind GraphPad Prism, versiunea 5.0 pentru Windows (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Mărimea eșantionului a fost determinată luând în considerare efectul mărimii. Statistica bilaterală cu un nivel de semnificație de 5% și potența de 0,98 a fost utilizată pentru a exclude erorile de tip II. În aceste condiții, dimensiunea recomandată a eșantionului necesară ar fi

; cu toate acestea, am optat pentru o dimensiune de

ca măsură de siguranță.

3. Rezultate

3.1. Dietele și caracterizarea denervării vagale

În primul rând, am caracterizat modelul subnutrit, care a prezentat greutate corporală redusă și proteine ​​totale serice (Figura suplimentară

disponibil online la https://doi.org/10.1155/2017/9652978). Apoi, am confirmat eficiența dietei bogate în grăsimi utilizate, deoarece șoarecii hrăniți cu această dietă au devenit obezi cu adipozitate crescută. Am confirmat, de asemenea, că vagotomia a redus greutatea corporală și tampoanele de grăsime (Figura 2 suplimentară), pe lângă toleranța îmbunătățită la glucoză și sensibilitatea la insulină la șoarecii obezi indusă doar de dieta bogată în grăsimi (Figura suplimentară 3), un efect bine cunoscut al acestei intervenții chirurgicale. În mod surprinzător, vagotomia nu a modificat greutatea corporală și adipozitatea la șoarecii LP + HFvag (Tabelul 1). Greutatea stomacului a fost mai mare la LP + HFvag comparativ cu cea la șoarecii LP + HF, confirmând eficiența vagotomiei. Glicemia și insulinemia de post au fost mai mari la LP + HF comparativ cu cea la șoarecii LP. Insulinemia de post, dar nu glicemia, a fost redusă în LP + HF vag în comparație cu cea de la șoarecii LP + HF (Tabelul 1). Cu toate acestea, nu am observat o diferență în insulinemia hrănită comparând LP + HF cu grupul LP + HFvag.

). a, b Diferențe semnificative (

3.2. Vagotomia a îmbunătățit toleranța la glucoză, dar nu și sensibilitatea la insulină

În timpul ipGTT, șoarecii LP + HF au avut glicemie crescută (Figura 1 (a)), indicând o afectare a toleranței la glucoză în comparație cu șoarecii LP, după cum s-a judecat după ASC (Figura 1 (b)). În mod interesant, vagotomia a restabilit toleranța la glucoză la șoarecii LP + HFvag la nivelurile celor observate în grupul LP, așa cum s-a observat în graficul ASC (Figura 1 (b)). În timpul ipITT (Figura 1 (c)), șoarecii LP + HF au prezentat afectarea sensibilității la insulină, comparativ cu grupul LP, așa cum a demonstrat KITT (Figura 1 (d)). Deși vagotomia nu a modificat sensibilitatea la insulină, șoarecii LP + HFvag au avut o insulinemie hrănită crescută (Tabelul 1), ceea ce ar putea explica toleranța îmbunătățită la glucoză la acești șoareci.

”Indicați diferențe semnificative între LP și LP + HFvag în comparație cu LP + HF; „#”, Între LP + HF și LP + HFvag; și „&”, între LP + HF și LP + HFvag în comparație cu LP. Diferite litere peste bare indică diferențe semnificative. ANOVA cu sens unic urmată de testul lui Tukey.

3.3. Vagotomie redusă GSIS în insulele pancreatice izolate

Pentru a explica insulinemia mai mare observată în timpul ipGTT al șoarecilor LP + HFvag, am accesat GSIS în insulele pancreatice izolate. La o concentrație scăzută de glucoză (5,6 mM), secreția de insulină a tuturor grupurilor a fost similară. Cu toate acestea, la concentrații mari de glucoză (11,1 și 16,7 mM), a fost observată o secreție crescută de insulină în insulele din LP + HF, comparativ cu șoarecii LP. Secreția de insulină a fost mai mică în insulele de la șoarecii LP + HFvag, atingând nivele similare cu cele observate pentru grupul LP (Figura 2 (a)). Conținutul total de insulină al insulelor din toate grupurile nu a fost semnificativ diferit (Figura 2 (b)).

). Diferite litere peste bare indică diferențe semnificative. ANOVA cu sens unic urmată de testul lui Tukey.

3.4. Eliminarea insulinei redusă prin vagotomie

GSIS inferior al șoarecilor LP + HFvag nu a justificat insulinemia mai mare găsită la acești șoareci în timpul ipGTT (Figura 3 (a)). Astfel, am evaluat și clearance-ul insulinei acestor șoareci (măsurând raportul C-peptidă: insulină). Se știe că pancreasul β celulele cosecretează insulina și peptida C într-un raport 1: 1; cu toate acestea, timpul de înjumătățire al peptidei C este mai lung decât cel al insulinei. Astfel, o creștere a raportului peptidă C: insulină indică un clearance crescut al insulinei, așa cum se observă în LP + HF, comparativ cu șoarecii LP (Figura 3 (c)). Interesant este faptul că clearance-ul insulinei a fost redus la șoarecii LP + HFvag, cu un raport scăzut al peptidei C: insulină, comparativ cu grupul LP + HF (Figura 3 (c)), explicând insulinemia mai mare a acestor șoareci în timpul ipGTT.

). Diferite litere peste bare indică diferențe semnificative. ANOVA cu sens unic urmată de testul lui Tukey.

3.5. Vagotomia a redus expresia IDE în ficatul șoarecilor LP

IDE este cea mai importantă proteină implicată în eliminarea insulinei, fenomen care apare în principal în ficat. Prin urmare, am evaluat expresia proteinei IDE în ficatul șoarecilor. Coroborând datele privind clearance-ul insulinei, șoarecii LP + HF au prezentat o expresie IDE mai mare, comparativ cu grupul LP (Figura 4). Expresia acestei enzime, în ficatul șoarecilor LP + HFvag, a fost redusă, returnându-și valorile similare cu cele găsite la șoarecii LP (Figura 4).


). Diferite litere peste bare indică diferențe semnificative. ANOVA cu sens unic urmată de testul lui Tukey.

4. Discutie

Studiile anterioare au demonstrat că șoarecii programați metabolici, hrăniți cu o dietă săracă în proteine ​​în timpul copilăriei, urmată de o dietă de control la vârsta adultă, au dezvoltat intoleranță la glucoză, asociată cu activitate vagală mărită [2]. Aici, am efectuat o vagotomie la șoareci menținuți cu un conținut scăzut de proteine, urmată de o dietă bogată în grăsimi, pentru a verifica un posibil rol al sistemului nervos parasimpatic asupra homeostaziei lor insulină-glucoză. Am observat că vagotomia a îmbunătățit toleranța la glucoză a șoarecilor metabolici programați prin scăderea clearance-ului insulinei, care apare probabil prin exprimarea redusă a IDE hepatic.

Se știe că obezitatea indusă de dietă, la șoareci, provoacă și intoleranță la glucoză însoțită de secreție crescută de insulină, care compensează rezistența la insulină periferică [17]. Acest fenomen a fost detectat și la șoarecii metabolici programați hrăniți cu o dietă săracă în proteine ​​la începutul vieții, urmată de o dietă obișnuită [2] sau o dietă bogată în grăsimi [5, 18] în timpul maturității. Aici, am confirmat aceste rezultate cu LP + HF care prezintă o sensibilitate la insulină afectată și toleranță la glucoză, precum și o secreție crescută de insulină.

Creșterea activității vagale la șoarecii obezi și metabolici a fost asociată cu creșterea în greutate și cu o secreție mai mare de insulină, în timpul alimentării [2, 19]. În plus, rozătoarele obeze vagotomizate au prezentat greutate corporală redusă, datorită tampoanelor de grăsime reduse, asociate cu o toleranță îmbunătățită la glucoză, sensibilitate la insulină și secreție. De fapt, am confirmat că vagotomia a fost eficientă pentru a induce toate aceste beneficii la șoarecii obezi induși de dietă (Figura S3). Cu toate acestea, greutatea corporală și tampoanele de grăsime, precum și acțiunea și secreția insulinei, au fost similare între șoarecii LP + HF și LP + HFvag. Aceste rezultate sugerează că îmbunătățirea observată în homeostazia glucozei, la șoarecii LP + HFvag, a fost independentă de modificarea compoziției corpului. Aceste constatări au confirmat că obezitatea indusă de programarea metabolică este mai problematică decât obezitatea în sine, deoarece șoarecii programați nu au prezentat beneficiile binecunoscute ale vagotomiei, cum ar fi reducerea adipozității și a greutății corporale [13, 20-22]. Același scenariu a fost observat atunci când șoarecii metabolici programați au primit supliment de taurină în încercarea de a-și îmbunătăți homeostazia glucozei-insulinei [18].

Contrar constatărilor noastre, rapoartele anterioare au demonstrat că vagotomia nu a modificat clearance-ul insulinei la porcii slabi [23]. Acest lucru sugerează că reducerea clearance-ului insulinei indusă de vagotomie este un fenomen observat doar la un model de șoarece obez, probabil pentru că au suferit malnutriție în timpul vieții timpurii. De fapt, la șobolanii obezi neprogramați, vagotomia a redus și secreția de insulină, dar spre deosebire de datele noastre, insulinemia a fost redusă [24], ceea ce ne întărește ideea că reducerea clearance-ului insulinei indusă de vagotomie poate fi dependentă de programarea metabolică. Deși nu a fost evaluat, se pare că șoarecii hrăniți cu o dietă săracă în proteine ​​la începutul vieții, urmată de o dietă obișnuită la vârsta adultă, dezvoltă, de asemenea, un clearance al insulinei scăzut. Această ipoteză se bazează pe observația că acestea prezintă o concentrație crescută de insulină plasmatică fără o creștere a secreției de insulină stimulată de glucoză [2]. Cu toate acestea, mecanismul prin care vagotomia a redus clearance-ul insulinei și expresia IDE hepatică rămâne neclar.

Deși clearance-ul insulinei redus și expresia IDE hepatică au fost asociate cu rezistența la insulină și dezvoltarea intoleranței la glucoză [25, 26], la începutul vieții, șoarecii IDE KO au prezentat o concentrație mai mare de insulină plasmatică și o toleranță îmbunătățită la glucoză. Cu toate acestea, menținerea concentrațiilor plasmatice ridicate de insulină pentru o perioadă îndelungată a dus la rezistența la insulină și intoleranță la glucoză la acești șoareci la vârsta de 6 luni [27]. Acest fenomen pare a fi cauzat de un feedback negativ al căii insulinei, orchestrat de supraestimularea cascadei proximale de insulină. Astfel, îmbunătățirea toleranței la glucoză, observată la șoarecii LP + HFvag, ar putea fi un efect tranzitoriu, iar acești șoareci sunt susceptibili să dezvolte intoleranță la glucoză și, în consecință, T2D.

În concluzie, vagotomia subdiafragmatică îmbunătățește toleranța la glucoză la șoarecii metabolici programați hrăniți cu o dietă săracă în proteine ​​la începutul vieții, urmată de expunerea la o dietă bogată în grăsimi la vârsta adultă. Vagotomia crește concentrația plasmatică a insulinei prin reducerea clearance-ului insulinei, un fenomen probabil datorat exprimării diminuate a IDE hepatice. Cu toate acestea, este necesar să rețineți că strategiile de inhibare a activității vagale, pentru controlul bolilor metabolice, pot pune în pericol toleranța la glucoză în timp.

Conflicte de interes

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese cu privire la publicarea acestui articol.

Contribuțiile autorilor

Everardo Magalhães Carneiro a supravegheat această lucrare.

Finanțarea

Această lucrare a fost susținută de Fundația Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; proces nr. 2013/27847-6, 2013/07607-8 și 2014/01717-9) și Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq).

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc pe Marise Brunelli, Julia Agulhari și Jheynifer Souza pentru asistență tehnică și pe Bridgett A. Bollin pentru editarea în limba engleză.

Materiale suplimentare