Martha S. Field

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Kelsey S. Shields

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Elena V. Abarinov

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Olga V. Malysheva

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Robert H. Allen

4 Departamentul de Medicină și Divizia de Hematologie, Universitatea din Colorado Centrul de Științe ale Sănătății, Denver, CO

Sally P. Stabler

4 Departamentul de Medicină și Divizia de Hematologie, Universitatea din Colorado Centrul de Științe ale Sănătății, Denver, CO

Jessica A. Ash

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Barbara J. Strupp

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Patrick J. Stover

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Marie A. Caudill

3 Division of Nutritional Science, Cornell University, Ithaca, NY; și

Abstract

Introducere

Gena Mthfd1 codifică o enzimă trifuncțională de metabolizare a folatului, C1-tetrahidrofolat (THF) 5 sintază, care joacă un rol important atât în ​​sinteza nucleotidelor, cât și în ciclul metioninei. Enzima C1THF sintază [denumită în mod obișnuit metilenetetrahidrofolat dehidrogenază 1 (MTHFD1)] conține o activitate de sintetază care catalizează conversia dependentă de ATP a formatului și THF în 10-formilTHF și activitatea ciclohidrolazei care catalizează interconversia 10-formilTHF și 5, 10-metenilTHF și o activitate dehidrogenază care reduce 5,10-metenilTHF la 5,10-metilen THF (1) FIG. 1 ).

redusă

Un model de lucru al efectelor metabolice ale deficitului de Mthfd1 asupra metabolismului 1-C mediat de colină și folat. Produsul genei Mthfd1 este C1THF sintază, care conține activități enzimatice FTHFS, MTHFC și MTHFD. „X” indică activități enzimatice care sunt reduse cu 50% în modelul de șoarece Mthfd1 gt/+. Metaboliții în cutie sunt cei care au fost măsurați în acest studiu: o cutie cu două căptușeli indică faptul că metabolitul a fost măsurat în ficat și o cutie cu o singură căptușeală indică faptul că metabolitul a fost măsurat în plasmă. Săgeată mai groasă, proces îmbunătățit prin reducerea activității MTHFD1; săgeată punctată, proces atenuat de activitatea MTHFD1 redusă. AdoHcy, S-adenosilhomocyteine; AdoMet, S-adenosilmetionina; 1-C, 1-carbon; CBS, cistationina β-sintaza; DMG, dimetilglicină; FTHFS, 10-formiltetrahidrofolat sintetaza; GPC, glicerofosfocolină; Hcy, homocisteină; Met, metionină; MTHFC, meteniltetrahidrofolat ciclohidrolază; MTHFD, metilenetetrahidrofolat dehidrogenază; MTHFR, 5,10-metilenetetrahidrofolat reductază; PC, fosfatidilcolină; SHMT, serin hidroximetiltransferază; THF, tetrahidrofolat.

Un produs al reacțiilor catalizate de sintază C1THF, 5,10-metilenTHF, există într-un punct ramificat în calea metabolică a folatului. 5,10-MetilenTHF este un donator de 1-carbon (1-C) pentru sinteza de novo a timidilatului sau alternativ poate fi redus ireversibil la 5-metilTHF de enzima 5,10-metilenetetrahidrofolat reductază (1). 5-MethylTHF este un donator de metil cheie pentru remetilarea homocisteinei la metionină, o reacție care este redundantă funcțional cu betaina: conversia catalizată de homocisteină metiltransferază a homocisteinei în metionină (2-4). Atât metabolismul 1-C mediat de folat, cât și degradarea colinei pot furniza în mod independent unități 1-C pentru remetilarea homocisteinei și, prin urmare, aceste 2 căi sunt strâns corelate. În consecință, modificările stării fie a folatului, fie a colinei pot duce la modificări proporționale ale stării celuilalt nutrient, așa cum se arată în mai multe modele de rozătoare (5-8) și studii la om (9-11).

Scopul principal al studiului actual a fost de a cuantifica efectele genotipului Mthfd1 gt/+ asupra biomarkerilor metabolismului colinei. Deoarece studiul nostru anterior a folosit o dietă deficitară atât în ​​folat cât și în colină, studiul actual a încercat să exploreze implicațiile perturbării Mthdf1 asupra metabolismului 1-C în condiții de deficit de folat alimentar numai.

Materiale și metode

Șoareci și diete experimentale.

Toate protocoalele de studiu au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Cornell și sunt conforme cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Șoarecii de studiu au fost generați prin încrucișarea șoarecilor femele C57Bl/6 la șoareci masculi 129P2/OlaHsd Mthfd gt/+. Șoarecii C57Bl/6 Mthfd1 gt/+ au fost descriși anterior (12). La înțărcare, descendenții masculi au fost repartizați aleatoriu fie la o dietă AIN-93G (22) (dietă de control, Dyets) care conținea 2 mg/kg acid folic, fie la o dietă AIN-93G modificată lipsită de acid folic [deficient de folat (FD) dietă, Dyets]. Toți șoarecii au fost hrăniți cu dietele respective pentru 5 săptămâni după înțărcare. Șoarecii experimentali au fost genotipați așa cum s-a descris în altă parte (12).

Recoltarea țesuturilor.

Șoarecii au fost uciși prin dislocare cervicală după 12 ore de lipsă de alimente. Sângele a fost colectat prin puncție cardiacă în tuburi acoperite cu heparină. Plasma a fost separată prin centrifugare și congelată în azot lichid. Probele de ficat au fost clătite cu PBS și congelate rapid în azot lichid, apoi depozitate la -80 ° C înainte de analiza colinei.

Analiza metaboliților plasmatici.

Homocisteina plasmatică totală, cistationina, cisteina totală, metionina, serina, glicina, acidul α-aminobutiric, N, N-dimetilglicina și N-metilglicina au fost analizate prin cromatografie de gaz capilar cu diluție stabilă a izotopilor-MS, așa cum s-a descris anterior (23, 24).

Analiza metaboliților colinei hepatice.

Cromatografia lichidă-MS a fost utilizată pentru măsurarea colinei libere, betainei și dimetilglicinei (25), precum și a fosfatidilcolinei, lizofosfatidilcolinei, sfingomielinei, fosfocolinei și glicerofosfocolinei (26) cu modificări pe baza instrumentelor noastre (11).

analize statistice.

Analiza statistică a fost efectuată utilizând un ANOVA cu 2 căi cu interacțiuni de interes incluse în modelul inițial (JMP, Institutul SAS). Efectele au fost considerate semnificative la P ≤ 0,05.

Rezultate

Genotipul Mthfd1gt/+ este asociat cu colină hepatică mai mare, betaină și dimetilglicină.

Așa cum se arată în tabelul 1, genotipul Mthfd1 gt/+ a fost asociat cu concentrații mai mari de colină, betaină și dimetilglicină în țesutul hepatic. Ficatul șoarecilor Mthfd1 gt/+ a avut colină cu 95% mai mare (P = 0,005), precum și dimetilglicină cu 50% mai mare (P = 0,004) și betaină (P = 0,013) față de șoarecii Mthfd1 +/+. Șoarecii Mthfd1 gt/+ au avut, de asemenea, concentrații cu 43% mai mici de glicerofosfocolină hepatică (P = 0,002) decât șoarecii Mthfd1 +/+ (Tabelul 1). În special, dieta FD nu a deranjat metaboliții colinei hepatice la șoarecii Mthfd1 +/+ sau Mthfd1 gt/+ și nici nu au fost detectate interacțiuni genetice (P> 0,10) (Tabelul 1).

TABELUL 1

Metaboliți hepatici ai colinei la șoareci +/+ gt/+ după 5 săptămâni de consum al controlului sau al dietei FD 1

+/+ gt /+ Valoarea efectului P
MetabolițiControlFDToateControlFDToateDietăGenotip
n101020101020
Colină, nmol/g346 ± 273248 ± 189299 ± 236621 ± 195552 ± 289585 ± 245ns0,005
Betaină, nmol/g418 ± 202331 ± 180376 ± 192618 ± 138563 ± 262589 ± 209ns0,013
Dimetilglicină, nmol/g38 ± 1338 ± 1238 ± 1354 ± 1454 ± 1554 ± 12ns0,004
Glicerofosfocolina, nmol/g173 ± 77225 ± 137198 ± 11099 ± 22125 ± 27113 ± 28ns0,002
Fosfocolina, nmol/g409 ± 215425 ± 287417 ± 245409 ± 176268 ± 87335 ± 151nsns
Fosfatidilcolină, μmol/g17,2 ± 2,7517,1 ± 2,2217,1 ± 2,4417,2 ± 1,8717,5 ± 0,9717,4 ± 1,43nsns
Sfingomielină, nmol/g567 ± 178626 ± 151595 ± 164738 ± 125657 ± 175695 ± 155ns0,05
Lizofosfatidilcolină, nmol/g506 ± 152498 ± 142502 ± 144523 ± 118570 ± 112548 ± 114nsns

Biomarkerii plasmatici ai metabolismului 1-C și transulfurării sunt modificați la șoarecii Mthfd1gt/+.

MASA 2

Profilul metabolic al plasmei de la șoareci +/+ gt/+ după 5 săptămâni de consum al controlului sau al dietei FD 1

+/+ gt /+ Valoarea efectului P
MetabolițiControlFDToateControlFDToateDietăGenotip
n101020101020
Homocisteină, μmol/L4,9 ± 0,68,0 ± 1,36,5 ± 1,96,1 ± 1,311,4 ± 3,68,8 ± 3,8 1 Datele sunt medii ± SD. Datele au fost analizate folosind un ANOVA cu 2 căi. ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ; ns, nesemnificativ, P> 0,10. Nu s-au detectat interacțiuni semnificative între genotip × dietă, P> 0,10, cu excepția faptului că homocisteina plasmatică a avut tendința de a fi mai mare la șoarecii Mthfd1 gt/+ hrăniți cu dieta FD comparativ cu Mthfd1 +/+ hrăniți fie cu dietă, fie cu Mthfd1 gt/+ hrăniți dieta de control. P-interacțiune = 0,08. FD, deficit de folat.

Discuţie

S-a demonstrat că șoarecele Mthfd1 gt/+ prezintă o afectare funcțională a metabolismului 1-C, deoarece concentrațiile hepatice de S-adenosilmetionină (AdoMet) sunt reduse, probabil datorită sintezei reduse de AdoMet prin ciclul metioninei (12). Aici, am observat alterarea metabolismului metioninei la șoarece Mthfd1 gt/+ sub formă de homocisteină crescută circulantă și scădere a metioninei circulante față de șoarecele Mthfd1 +/+. Aceste descoperiri indică în mod colectiv că întreruperile activității C1THF sintază reduc producția de 5,10-metilen THF și în cele din urmă 5-metilTHF, coenzima folatului care participă la remetilarea homocisteinei la metionină (Fig. 1) (2, 19, 27) ).

Reacția serină hidroximetiltransferază oferă o cale alternativă la sinteza 5,10-metilen THF prin C1-THF sintază. Serina hidroximetiltransferază transferă C3 de serină la THF generând 5,10-metilen THF și glicină (28, 29). În studiul de față, șoarecii Mthfd1 gt/+ au avut concentrații mai mici de serină circulantă față de șoarecii Mthfd1 +/+, sugerând utilizarea crescută a serinei ca sursă de 1-C pentru ciclul metioninei și/sau biosinteza timidilatului nuclear (12) ( Fig. 1).

Perturbările din ciclul metioninei datorate genotipului Mthfd1 gt/+ par a avea implicații importante pentru biochimia transsulfurării (Fig. 1). Șoarecii Mthfd1 gt/+ au scăzut concentrațiile plasmatice de cistationină, care este produsă din homocisteină de cistationina β-sintază (CBS), enzima reglatoare din calea transsulfurării (30, 31). Deoarece AdoMet este necesar pentru a activa CBS (31, 32), AdoMet diminuat, așa cum se vede în ficatul șoarecilor Mthfd1 gt/+ (12), ar fi de așteptat să ducă la scăderi concurente ale activității specifice CBS, atenuând astfel conversia de homocisteină la cistationină și conservarea homocisteinei pentru producția de AdoMet. Ca precursor al cisteinei, care este produsul final al căii de transsulfurare, disponibilitatea redusă a cisteioninei ar putea prezice niveluri reduse de cisteină (33). Cu toate acestea, cisteina circulantă a fost mai mare la șoarecii Mthfd1 gt/+ decât la șoarecii Mthfd1 +/+. Sugerăm că, similar cu ceea ce se observă cu alți nutrienți (34), organele extrahepatice acționează pentru a furniza ficatului Mthfd1 gt/+ cu cisteină, care poate fi metabolizată în continuare în glutation, un agent de reducere major din corp care este obișnuit combate stresul oxidativ (35, 36).

În acest studiu, activitatea scăzută a MTHFD1 a avut un impact mai mare asupra metabolismului 1-C comparativ cu dieta FD și nu a existat nicio interacțiune între genotipul Mthfd1 și folatul dietetic redus. Descoperirile noastre că dieta FD nu a exacerbat efectele negative ale genotipului Mthfd1 gt/+ asupra colinei și markerilor metabolici 1-C indică faptul că cele 3 activități enzimatice asociate cu MTHFD1 nu sunt foarte dependente de concentrațiile de folat intracelular, așa cum sa observat pentru alte enzime dependente de folat (37).

Modificările complete ale căilor metabolice ale colinei, folatului și metioninei observate la șoarecii Mthfd1 gt/+ sunt în mod similar similare cu modificările asociate cu polimorfismul MTHFD1 G1958A și susțin în continuare utilizarea șoarecilor Mthfd1 gt/+ ca model de folat perturbat. și metabolismul 1-C dependent de colină și de deficiențe umane ereditare de MTHFD1. În general, rezultatele acestui studiu oferă informații importante despre schimbările metabolice care ar fi de așteptat să apară din insuficiența umană de MTHFD1, cum ar fi în G1958A și alte SNP-uri MTHFD1 recent identificate (21). Rezultatele studiului pot informa, de asemenea, abordări de tratament dietetic, cum ar fi necesitatea unui aport mai mare de colină în rândul persoanelor cu SNP MTHFD1 dăunătoare.

Mulțumiri

M.S.F., E.V.A., J.A.A., B.J.S., P.J.S. și M.A.C. proiectat studiul; E.V.A. a coordonat studiul și a colectat țesuturile; O.V.M., R.H.A. și S.P.S. efectuat analize analitice; M.S.F. și J.A.A. a analizat datele și a efectuat analize statistice; M.S.F., K.S.S., M.A.C. și P.J.S. a pregătit manuscrisul; și M.A.C. are responsabilitatea primară pentru conținutul final. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Note de subsol

5 Abrevieri utilizate: AdoMet, S-adenosilmetionina; 1-C, 1-carbon; CBS, cistationina β-sintaza; FD, deficit de folat; MTHFD, metilenetetrahidrofolat dehidrogenază; SNP, polimorfism cu un singur nucleotid; THF, tetrahidrofolat.