H.Z. și F.Z. a contribuit în mod egal la această lucrare.

aminoacizii

Abstract

Introducere

Obezitatea și bolile metabolice asociate, cum ar fi rezistența la insulină și diabetul zaharat de tip 2 (T2DM), au devenit probleme majore de sănătate la nivel mondial (1). Obezitatea este asociată cu depozitarea crescută a lipidelor în țesuturile ectopice, cum ar fi ficatul, mușchiul scheletic și rinichii (2). Acumularea de lipide ectopice în ficat este cunoscută sub numele de boală hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) și este strâns asociată cu rezistența la insulină (3). NAFLD poate fi împărțit în steatoză simplă și steatohepatită nealcoolică (NASH). După cum se știe, grăsimea hepatică se diminuează odată cu progresia NASH, care a fost desemnată NASH arsă (4). Acest fenomen implică modificarea metabolismului lipidelor hepatice cu progresia NAFLD, dar mecanismele asociate rămân necunoscute.

Glucidele și grăsimile dietetice sunt asociate cauzal cu dezvoltarea rezistenței la insulină (11). Deși efectele periculoase ale glucozei ridicate și ale conținutului ridicat de grăsimi (HF) asupra homeostaziei metabolice hepatice sunt bine recunoscute, impactul aportului ridicat de proteine ​​asupra tulburărilor metabolice hepatice asociate obezității rămâne neclar. BCAA (leucina, izoleucina și valina) sunt un grup de aminoacizi esențiali. Relativ abundente în alimente, ele reprezintă aproximativ 15-25% din aportul total de proteine ​​(13). Studii recente sugerează că BCAA sunt asociate cu dezvoltarea T2DM (14) și NAFLD (11). În special, concentrațiile crescute de BCAA circulante prezic puternic riscul de T2DM (15). Direcționarea catabolismului BCAA este o strategie potențială pentru tratarea rezistenței la insulină asociată cu obezitatea (16). Împreună, aceste studii clinice sugerează că BCAA pot avea un impact negativ asupra homeostaziei metabolice hepatice, în special în stările rezistente la insulină. Cu toate acestea, dacă BCAA crescute joacă un rol cauzal în tulburarea metabolismului hepatic al glucozei și lipidelor rămâne neidentificat.

Aici, încercăm să elucidăm rolul BCAA-urilor asupra metabolismului hepatic al glucozei și lipidelor și în facilitarea dezvoltării rezistenței la insulină în stări severe și tulburări metabolice sistemice ale glucozei și lipidelor și să determinăm în continuare semnificația și să clarificăm mecanismele de bază.

Proiectare și metode de cercetare

Animale

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile Institutelor Naționale de Sănătate pentru animalele de laborator și au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Medicală Militară a Forțelor Aeriene. Șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic masculi adulți au fost cumpărați de la Centrul pentru animale al Universității de Medicină Militară a Forțelor Aeriene. Toți șoarecii au fost crescuți într-o instalație cu temperatură controlată și au fost menținuți pe fundalul de 26 ± 2 ° C și 55 ± 15% umiditate relativă cu un ciclu constant de 12 ore de lumină/întuneric.

Șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic au fost împărțiți în mod aleatoriu în patru grupuri: un grup alimentat cu dietă normală (ND), un grup HF alimentat cu dietă, un grup HF plus BCAA alimentat (HF/BCAA) și un grup HF/asociat în care aportul caloric a fost egalat cu cel al grupului HF/BCAA. Toți șoarecii au fost hrăniți timp de 16 săptămâni cu acces gratuit la apă sau alimente. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost monitorizate la fiecare 3 zile și calculate ca kcal/g/săptămână. Virusul adeno-asociat serotip-9 (AAV9) -myr-Akt2 cu un promotor larg de citomegalovirus a fost livrat prin injecție de venă coadă și s-au administrat 1,2 × 10 11 vectori sau genomi pentru fiecare șoarece. Secvența myr este atggggagcagcaagagcaagcccaagtctaga.

Șoarecii au fost eutanasiați cu izofluran. Sângele a fost colectat prin artera carotidă. Țesuturile au fost colectate după sacrificarea animalelor și congelate imediat în azot lichid. Pentru studiile de repunere în repaus alimentar, șoarecii au fost repede post peste noapte și apoi au fost reîncărcați timp de 6 ore.

Hrana cu diete HF

Protocoalele de hrănire pereche au fost realizate așa cum s-a descris anterior (17). Pentru a efectua un test de hrănire pereche, am determinat mai întâi greutatea corporală totală a grupului HF/BCAA (A g) și am calculat caloriile totale consumate (B) în fiecare zi [B = [calorii totale furnizate - calorii în alimentele nemâncate]/zi) și caloriile consumate pe zi pe baza nivelurilor de BCAA din apa potabilă (C cal). Am determinat apoi caloriile consumate per gram de greutate corporală (D cal/g) = (B [cal] + C [cal])/greutatea corporală totală (A g). Apoi, am măsurat greutatea corporală totală (E g) a grupului HF/asociat și am calculat cantitatea de alimente dietetice HF care ar trebui administrată grupului HF/asociat (F cal) (F = D ∗ E) în următoarele zi. Mâncarea totală a fost împărțită în două porții și furnizată la ore separate (8:00 a.m. și 6:00 p.m.) pentru a evita foametea. O dietă de 60% HF fără BCAA a fost furnizată grupului HF/asociat.

Dietele utilizate în acest studiu

Dieta HF (60% din kcal din grăsimi, D12492) a fost utilizată pentru a induce rezistența la insulină asociată cu obezitatea, așa cum sa raportat anterior (18), și un ND (10% din kcal din grăsimi, D12450) a fost utilizat ca ND care a fost hrănit către grupul de control. Ambele alimente au fost achiziționate de la Research Diets. BCAA (4%) au fost dizolvate în apă potabilă la un raport leucină-izoleucină-valină de 2: 1: 1 (19).

Studii metabolice

Testele de toleranță la glucoză (GTT) și testele de toleranță la insulină (ITT) au fost efectuate așa cum s-a raportat anterior (20). Șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu insulină umană (Eli Lilly) la 0,75 UI/g corp greutate sau 20% glucoză la 2,0 mg/g greutate corporală după privarea alimentară peste noapte. Glicemia a fost măsurată la 0, 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectare.

Test de toleranță piruvat

Șoarecii au fost postiti timp de 16 ore înainte de o injecție intraperitoneală de piruvat de sodiu (2 g/kg corp greutate). Glucoza plasmatică a fost măsurată la 0, 15, 30, 60, 90 și 120 min după injectare, iar probele de sânge au fost colectate din vena cozii.

Culturi hepatocitare primare

Hepatocitele primare au fost izolate de la șoareci WT C57BL/6J de sex masculin de 8 până la 10 săptămâni. Izolarea hepatocitelor a fost efectuată folosind o metodă de perfuzie în două etape a colagenazei, după cum sa raportat anterior (21). Pe scurt, perfuzia prin vena portal hepatică a început succesiv cu 40 ml PBS, 20 ml soluție D-Hanks conținând 0,1 mmol/L EDTA și 40 ml 0,05% soluție de colagenază tip IV. Ficatul a fost îndepărtat chirurgical, iar hepatocitele primare au fost placate în vase acoperite cu colagen I. Viabilitatea hepatocitelor primare, evaluată prin excluderea albastru tripan, a fost> 90%.

Infecția cu Adenovirus (Vector Biolabs) a fost efectuată la 6 ore după placare (multiplicitatea infecției 10). După 6 ore de infecție, celulele au fost spălate de două ori cu PBS și serul a murit de foame peste noapte înainte de stimularea insulinei. Controlul fără țintire și INSIG2 siARN sau Mul1 siARN au fost transfectate tranzitoriu în hepatocite primare la 6 ore după placare cu Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La 24 de ore după transfecție, celulele au fost înfometate cu ser peste noapte înainte de stimularea insulinei. Secvențele INSIG2-siRNA au fost după cum urmează: CGGUGUUCGUGGGUAUAAATT (sens catenă) și UUUAUACCCACGAACACCGTT (catenă antisens). Secvențele mul1-siARN-urilor au fost după cum urmează: GCGAGAGGCCCAAAGGCAUTT (sens catenă) și AUGCCUUUGGGCCUCUCGCTT (catenă antisens).

Test de producție a glucozei in vitro

Testele de producție a glucozei în hepatocitele primare au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (11). Hepatocitele au fost înfometate cu ser timp de 24 de ore și înlocuite cu mediu de producere a glucozei și incubate timp de 5 ore cu vehicul, 100 μmol/L 8-CPT - cAMP (Sigma-Aldrich), sau cAMP plus 10 nmol/L insulină. Nivelurile de glucoză din mediul de cultură au fost determinate prin testul peroxidază-glucoză oxidază (Sigma-Aldrich) și normalizate la niveluri de proteine ​​în același puț. Pentru grupul de tratament Aktviii, Aktviii a fost adăugat la mediu fără ser cu 30 de minute înainte de tratamentul cu insulină sau vehicul. Au fost utilizate celule suplimentare pentru a determina expresia genelor cheie care controlează gluconeogeneza.

Imunoblotarea

Au fost preparate lizatele din țesutul hepatic al șoarecilor și hepatocitele primare. Proteina totală din țesutul hepatic și hepatocitele primare a fost izolată folosind tampon de liză pentru testul radioimunoprecipitării (Beyotime, Shanghai, China) cu inhibitori de protează și fosfatază. Concentrația de proteine ​​a fost cuantificată folosind un kit de testare a proteinelor acidului bicinchoninic (Beyotime). Extractele de proteine ​​au fost separate prin SDS-PAGE, transferate pe membranele de nitroceluloză (Millipore) și incubate cu anticorpii indicați (enumerați în Tabelul suplimentar 1), urmată de incubarea anticorpului secundar conjugat cu peroxidază de hrean. Anticorpii au fost diluați 1: 1.000 în soluție salină tamponată cu Tris. Benzile au fost detectate folosind substratul de peroxidază hrean chemiluminiscentă Immobilon Western (Millipore) și au fost realizate cu imagini folosind ChemiDoc Imaging Systems (Bio-Rad). β-Actina a servit drept control pentru normalizarea expresiei proteinelor.

Coimmunoprecipitarea

Celulele din plăci cu șase godeuri au fost spălate de trei ori cu PBS și lizate în tampon de liză cu test de radioimunoprecipitare rece ca gheața cu inhibitori de protează/fosfatază. Lizatele au fost incubate pe gheață timp de 30 de minute și apoi centrifugate la 12.000 g timp de 15 minute. Supernatanții au fost incubați cu anticorpi primari timp de peste 12 ore la 4 ° C. Ulterior, o probă de proteină Dynabeads G (Life Technologies) a fost adăugată probelor și incubată la 4 ° C timp de 2 ore. Proteinele imunoprecipitate au fost eluate, denaturate și fierte timp de 5 minute pentru Western blot.

Analiza expresiei genelor

Pentru analize de expresie genică, ARN total din hepatocite primare și țesut hepatic a fost extras folosind reactivul TRIzol (Invitrogen). ADNc a fost sintetizat folosind un kit RNA PCR (Takara Bio, Shiga, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. SYBR PCR cantitativ în timp real pe bază de verde a fost realizat folosind un sistem de PCR în timp real aplicat Biosystems 7300. Probele triplicate au fost recoltate pentru fiecare tratament. Valorile relative ale expresiei au fost calculate ca raportul dintre ADNc țintă și β-actină. Toate datele au fost analizate utilizând software-ul GraphPad Prism 7. Secvențele de perechi primare sunt listate în Tabelul 1 suplimentar.