Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang, Harbin, China

analiza

Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang, Harbin, China

Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang, Harbin, China

Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang, Harbin, China

Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang, Harbin, China

Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea Heilongjiang de Medicină Chineză, Harbin, China

Departamentul de afiliere pentru analize farmaceutice, Laboratorul cheie de metabolomică și chinmedomică, Laboratorul național TCM de farmacochimie serică, Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang, Harbin, China

  • Hui Soare,
  • Shuxiang Zhang,
  • Aihua Zhang,
  • Guangli Yan,
  • Xiuhong Wu,
  • Ying Han,
  • Xijun Wang

Cifre

Abstract

Metabolomica reprezintă o disciplină emergentă preocupată de evaluarea cuprinzătoare a metaboliților endogeni cu molecule mici din sistemele biologice și oferă o perspectivă puternică asupra mecanismelor bolilor. Diabetul de tip 2 (T2D), numit povara secolului 21, crește odată cu o rată epidemică. Cu toate acestea, mecanismul său molecular precis nu a fost explorat în mod cuprinzător. În acest studiu, am aplicat metabolomica urinară pe baza UPLC/MS integrată cu abordări de recunoaștere a modelelor pentru a descoperi metaboliți diferențiați, pentru a caracteriza și a explora întreruperea căii metabolice într-un model experimental pentru T2D indusă de o dietă bogată în grăsimi. S-au găsit șase metaboliți urinari diferențiați în modul negativ și doi (2- (4-hidroxi-3-metoxi-fenil) acetaldehidă sulfat, 2-feniletanol glucuronid) dintre care au fost identificați implicând căile metabolice cheie legate de interconversiile pentoză și glucuronat, amidon, metabolismul zaharozei și metabolismul tirozinei. Studiul nostru oferă o nouă perspectivă asupra mecanismelor fiziopatologice și poate îmbunătăți înțelegerea patogenezei T2D.

Citare: Sun H, Zhang S, Zhang A, Yan G, Wu X, Han Y și colab. (2014) Analiza metabolomică a diabetului de tip 2 indus de dietă utilizând UPLC/MS integrat cu abordarea de recunoaștere a modelelor. PLoS ONE 9 (3): e93384. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093384

Editor: Daniel Monleon, Institutul de Investigare Sanitară INCLIVA, Spania

Primit: 9 august 2013; Admis: 4 martie 2014; Publicat: 26 martie 2014

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvenții din cadrul Programului cheie al Fundației de Stat pentru Științe Naturale (Grant nr. 90709019), Programul național de cercetare și dezvoltare tehnologică cheie al Ministerului Științei și Tehnologiei din China (Grant nr. 2011BAI03B03, 2011BAI03B06, 2011BAI03B08), Programul științific și tehnologic cheie al provinciei Heilongjiang, China (Grant nr. GC06C501, GA08C303, GA06C30101), Fundația Universității de Medicină Chineză din Heilongjiang (Grant nr. 201209) și Subiectul cheie național al inovării medicamentelor (Grant nr. 2009ZX09502-005 ). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Metabolomica se poate presupune că la indivizii cu T2D este posibil ca multe căi metabolice să fie afectate și probabil că joacă un rol în disfuncția lor metabolică generală. Astfel, identificarea de noi biomarkeri și căi poate îmbunătăți caracterizarea alterărilor fiziopatologice asociate cu T2D [6]. Înțelegerea rețelelor biochimice va ajuta la clarificarea etiologiei diabetului și ar trebui să încurajeze descoperirea de noi biomarkeri de risc și severitate a bolii. Am raportat anterior o analiză a metabolomicii cantitative țintite, în care am arătat că multe observații cunoscute și noi ale modificărilor metabolice pot fi descoperite folosind o astfel de abordare metabolomică [7] - [10]. Metoda are puterea de a identifica perturbațiile homeostaziei metabolice ale organismului și, prin urmare, oferă acces la markerii căilor metabolice afectate de boală [11] - [13]. Prin utilizarea acestei abordări cuprinzătoare de profilare biochimică, încercăm să identificăm metaboliții cu concentrații diferite în T2D, permițând astfel noi perspective asupra progresiei fiziopatologice a acestei importante boli metabolice.

Diferite tehnici analitice, cu analize de date multivariate, cum ar fi analiza parțială cu discriminare minimă pătrată (PLS-DA) au fost aplicate în studiile de metabolizare bazate pe metabolomică [14]. UPLC cuplat cu SM a devenit una dintre tehnicile aplicate pe scară largă în metabolomică datorită sensibilității și reproductibilității sale ridicate [15] - [20]. Aici, metabolomica urinară bazată pe UPLC-MS a fost aplicată pentru a investiga profilurile metabolice și potențialii biomarkeri într-un model de șobolan T2D, care poate facilita înțelegerea modificărilor patologice ale T2D și poate obține o vedere sistematică a disecției mecanismelor T2D.

Materiale și metode

Substanțe chimice și reactivi

Acetonitrilul (clasa HPLC) a fost achiziționat de la Dikma Technology Inc. (Compania Dima, SUA). Apa deionizată a fost purificată prin sistemul Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, SUA). Acidul formic (clasa HPLC, FA) a fost achiziționat de la compania honeywell (SUA). Encefalina leucină a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich (MO, SUA). Emulsia bogată în grăsimi a fost preparată de laboratorul nostru. Pe scurt, untură de porc 20 g, metil tiouracil 1 g, colesterol 5 g, glutamat de sodiu 1 g, zahăr 5 g, fructoză 5 g, propilen glicol 30 ml au fost amestecate și s-au adăugat volum de apă la 100 ml și s-au pregătit pentru emulsie bogată în grăsimi (vezi Ref. 21).

Declarație de etică

Studiul nostru a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Universitatea de Medicină Chineză Heilongjiang. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale de la Universitatea de Medicină Chineză din Heilongjiang (numărul permisului: CEAE-HUCM-0126104). S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Manipularea animalelor

Colectarea și pregătirea probelor

Toți șobolanii din fiecare grup au fost adăpostiți în cuști metabolice (1 pe cușcă). Urina a fost colectată zilnic (la 6:00 a.m.) din cuști de metabolism la temperatura ambiantă pe parcursul întregii proceduri și centrifugată la 13.000 rpm la 4 ° C timp de 5 min, iar supernatanții au fost depozitați congelați la -80 ° C până la analiză. Toate aceste probe au fost decongelate la temperatura camerei înainte de analiză și centrifugate la 13.000 rpm timp de 5 minute. O alicotă de 5 uL a fost injectată pentru analiza UPLC/MS după filtrarea printr-un filtru cu membrană de 0,22 um.

Profilarea metabolică

Cromatografie.

UPLC/ESI-Q-TOF/MS a fost utilizat pentru analiza globală a probelor de urină. Analiza cromatografică a fost efectuată într-un sistem Waters ACQUITY UHPLC controlat cu Masslynx (V4.1, Waters Corporation, Milford, SUA). O alicotă de 6 μL de soluție de probă a fost injectată pe o coloană ACQUITY UPLC BEH C18 (50 mm × 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, SUA) la 35 ° C, debitul a fost de 0,5 ml/min și injecția volumul a fost de 2 μL. Faza mobilă optimă a constat dintr-un sistem de gradient liniar de (A) 0,1% acid formic în apă și (B) 0,1% acid formic în acetonitril, 0-1 min, 99-90% A; 1-4 min, 90-80% A; 4-6 min, 80-65% A; 6-9 min, 65-1% A; 9-11 min, 1% A; 11–11,5 min, 1–99% A, 11,5–13 min, 99% A. În plus, eșantionul QC a fost utilizat pentru a optimiza starea UPLC-Q-TOF/MS, deoarece conținea cele mai multe informații despre probele de urină întreagă . O probă QC a fost operată la fiecare 6 probe de urină pentru a evalua stabilitatea în timpul analizei secvenței. Ori de câte ori s-a terminat o injecție de probă, s-a făcut un ciclu de spălare a acului pentru a îndepărta resturile și a se pregăti pentru următoarea probă. În plus, eluantul a fost transferat direct în spectrometrul de masă, adică fără o despărțire.

Spectrometrie de masa

Spectrometria de masă a fost acționată prin ionizare prin electrospray în modul de ionizare negativă. Eluantul a fost introdus în analiza spectrometrului de masă de înaltă definiție (Waters Corp., Milford, SUA), iar condițiile optime de analiză au fost următoarele: temperatura sursei a fost setată la 110 ° C, temperatura gazului de desolvatare a fost de 350 ° C, debitul de gaz conic a fost de 50 h, debitul de gaz de desolvatare a fost de 600 L/h; tensiunea capilară a fost de 2,3 kV, tensiunea conului de eșantionare a fost de 35 V, tensiunea plăcii microcanale a fost de 2450 V și tensiunea conului de extracție a fost de 3,0 V. Rata de achiziție a datelor a fost setată la 0,14 s/scanare, cu o întârziere de scanare de 0,1 s . Datele au fost colectate în modul centroid de la 100 la 1000 Da. Pentru o achiziție precisă de masă, a fost utilizată o masă de blocare a leucinei encefalinei la o concentrație de 0,2 ng/ml printr-o interfață de pulverizare de blocare la un debit de 100 μl · monitorizare min-1 pentru modul ion negativ ([M + H] - = 556.2615) pentru a asigura precizia în timpul analizei MS.

Analiza și prelucrarea datelor multivariate

Datele brute UPLC-MS au fost importate în software-ul MassLynx ™ (Waters Corp.) pentru detectarea și alinierea vârfurilor. Intensitatea fiecărui ion a fost normalizată în raport cu numărul total de ioni pentru a genera o matrice de date care a constat din timpul de retenție, valoarea m/z și zona de vârf normalizată. Matricea de date multivariate a fost analizată de software-ul EZinfo 2.0 (Waters Corp., Milford, SUA). Toate variabilele au fost pareto-scalate înainte de PLS-DA. Aici, PLS-DA au fost utilizate pentru a procesa datele UPLC-MS dobândite. În modelarea PLS-DA, metaboliții endogeni care contribuie la clasificare au fost identificați în loturile de încărcare, care au arătat importanța fiecărei variabile pentru clasificare. Testul t al studentului a fost efectuat pentru a identifica caracteristici cu abundențe diferențiale între grupuri.

Identificarea căii metabolice

Biomarkerii de interes au fost extrasați din graficele de încărcare PLS-DA pe baza contribuției lor la variația și corelația din cadrul setului de date. În ceea ce privește identificarea potențialilor biomarkeri, spectrul ionic a fost asociat cu mesajul de structură al metaboliților dobândiți din bazele de date biochimice, cum ar fi HMDB, http://www.hmdb.ca/; KEGG, http://www.genome.jp/kegg/; METLIN, http://metlin.scripps.edu/; Entități chimice de interes biologic (http://www.ebi.ac.uk/Databases/); MassBank, http://www.massbank.jp/; Centrul Scripps pentru Spectrometrie de Masă (http://masspec.scripps.edu/index.php) și Lipidmaps (http://www.lipidmaps.org/). Reconstrucția și analiza căii potențialilor biomarkeri au fost efectuate cu software-ul MetPA bazat pe sursa bazei de date.

Rezultate

Analiza statistică multivariată a urinei de șobolan

Parametrii biochimici ai grupului de control și ai grupului T2D au fost rezumați în Tabelul 1. Rezultatele biochimice observate în grupul T2D au arătat o diferență semnificativă în comparație cu grupul de control. În acest studiu, a fost stabilită și utilizată o metodă PLS-DA pentru a identifica biomarkeri care au fost legați de dezvoltarea T2D. Așa cum Fig. 1, există o clasificare distinctă între gruparea grupurilor de control și T2D. Conform rezultatelor graficului S, un total de 6912 ioni variabili (Fig. 2) au fost semnificativ diferiți între grupurile martor și model. În cele din urmă, 6 dintre ele în mod negativ au fost identificate prin căutarea fragmentelor MS și MS/MS în baza de date a metaboliților și, în cele din urmă, confirmate de standardele comerciale (tabelul S1).

Probele de urină de la șobolanii lotului martor și grupului T2D au fost supuse UPLC/MS. Modelul PLS a fost apoi utilizat pentru a genera încărcări S-plot care arată ioni importanți pentru gruparea eșantioanelor. Punctele de date din casetă indică faptul că ionii sunt cei mai responsabili pentru varianța în graficul scorului.

Identificarea candidaților la metaboliți

Informațiile, inclusiv timpul de păstrare, masa exactă și datele ms/ms au fost furnizate de platforma robustă UPLC-MS. Masa moleculară precisă a fost determinată într-un grad rezonabil de eroare de măsurare utilizând Q-TOF și s-au obținut, de asemenea, compoziția potențială a elementelor, gradul de nesaturare și abundența izotopului fracțional. Identificarea metabolitului a fost efectuată cu fragmente MS de înaltă rezoluție și fragmente MS/MS, precum și analize de baze de date. Am căutat formula moleculară presupusă în baza de date ChemSpider, Metabolom uman, KEGG și Baza de date a căilor moleculare mici pentru a confirma posibile compoziții chimice. Conform protocolului descris mai sus, șase metaboliți endogeni au fost identificați și rezumați în tabelul S1.

Rețeaua de biomarkeri și reconstrucția căii metabolice

Căile conexe ale biomarkerilor au fost investigate prin căutarea KEGG și HMDB și a fost stabilită o rețea a unor biomarkeri. Analiza căilor metabolice cu MetPA a relevat că biomarkerii potențiali sunt implicați în principal în calea interconversiilor pentozei și glucuronatului, a metabolismului amidonului și zaharozei și a metabolismului tirozinei care s-au schimbat în mod specific în cadrul T2D (Fig.3). Doi metaboliți diferiți (2-feniletanol glucuronid, 2- (4-hidroxi-3-metoxi-fenil) acetaldehidă sulfat) identificați din aceste căi au fost implicați în dezvoltarea T2D, ceea ce a indicat faptul că disfuncția căilor multiple a fost implicată în procesul patologic al T2D. Construcția detaliată a căilor de metabolism cu scor mai mare a fost prezentată în Fig.3. Rezultatele au sugerat că aceste căi țintă au arătat perturbări marcate pe parcursul timpului T2D și ar putea contribui la dezvoltarea T2D.

Identificarea căii de rețea prin software MetPA (A). Căile metabolice putative ale interconversiilor de pentoză și glucuronat (B), metabolismului amidonului și zaharozei (C) și metabolismului pirimidinei (D) au fost deduse din urina de șobolan a intermediarilor în timpul metabolismului substanței. Harta a fost generată folosind harta de referință de către KEGG. Roșu indică metaboliții afectați legați de cale. α, 2-feniletanol glucuronid; b, 2- (4-hidroxi-3-metoxi-fenil) acetaldehidă sulfat.

Discuţie

Metabolomica este o disciplină în evoluție rapidă, care implică studiul sistematic al moleculelor endogene mici care caracterizează căile metabolice ale sistemelor biologice [23]. A fost studiat pe larg în bolile umane și a dus la progrese semnificative în înțelegerea fiziopatologiei bolilor. Diabetul reprezintă una dintre cele mai importante probleme globale de sănătate și aproximativ 90% dintre pacienții cu diabet zaharat au T2D, iar incidența acestuia rămâne cea mai mare din lume [24]. Din fericire, metabolomica a introdus noi perspective asupra patologiei diabetului, precum și metode de prezicere a apariției bolii și a dezvăluit noi biomarkeri. Recent, s-au dezvoltat o varietate de biomarkeri care reflectă patologiile T2D pentru a obține noi informații despre căile metabolice și mecanismele fiziopatologice [25]. Deoarece unele dintre procesele identificate mai sus pot avea ca rezultat „semnături” metabolice în urină, ceea ce ar fi util atât pentru diagnosticul T2D, cât și pentru reacția terapeutică. Deși s-au depus eforturi mari pentru a descoperi mecanismele moleculare complexe exploatate în patogeneza bolii T2D, rămâne de descoperit o explicație satisfăcătoare.

Concluzii

Tehnologiile emergente de metabolomică cu randament ridicat au fost aplicate pe scară largă, urmărind descoperirea biomarkerilor candidați pentru boală și pot ajuta la înțelegerea mecanismului apariției T2D la nivel metabolic. Aici, ilustrăm modul în care metabolomica poate fi utilizată pentru a explora mecanismele T2D care afectează diferite „căi cheie”. T2D este una dintre cele mai frecvente boli din lume, dar în prezent este dificil să se determine fiziopatologia precisă. Aici, am aplicat abordarea metabolomică bazată pe UPLC/MS pentru a investiga în mod sistematic T2D. Interesant este că 3 căi distincte, cum ar fi interconversiile pentozei și glucuronatului, metabolismul amidonului și zaharozei, și metabolismul tirozinei etc. au fost găsite asociate cu T2D în conformitate cu analiza căii de ingeniozitate. Pe baza constatărilor noastre, se sugerează că abordarea metabolomicii este extrem de eficientă în a ajuta identificarea biomarkerului T2D. Detectarea continuă, dinamică și neinvazivă a metaboliților din urina șobolanilor T2D a fost demonstrată cu succes și ne va spori înțelegerea proceselor fiziopatologice implicate și ne va ajuta să identificăm potențiali biomarkeri pentru a dezvolta noi strategii terapeutice.

informatii justificative

Tabelul S1.

O listă cu potențiali biomarkeri urinari ai probelor de urină din diabetul de tip 2.