Inhibitorii TrxR reduc creșterea celulară și determină apoptoza în celulele CML. A-D: Celulele K562 și KU812 au fost tratate cu auranofină (A, B) și [Au (d2pype) 2] Cl (C, D) timp de 24 și 48 de ore. Creșterea celulară a fost apoi măsurată utilizând testul de proliferare MTT. E, F: K562 și respectiv KU812 au fost tratați cu auranofină sau [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore, apoi s-a măsurat activitatea caspazei-3, utilizând un test fluorogenic pe bază de Ac-DEVD-AMC. G, H: Ambele linii celulare au fost tratate cu 4 uM de Auranofin sau [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Western blot a fost efectuată utilizând un anticorp specific pentru PARP-1 (C-PARP) de 89kDa scindat. T-Tubulin a fost utilizat ca control de încărcare. Rezultatele MTT au fost analizate prin ANOVA bidirecțional cu testul post hoc al lui Dunnett. Activitatea Caspase-3 a fost analizată cu mai multe teste T. Testele statistice au comparat datele din celulele tratate și netratate. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Inhibitorii TrxR scad activitatea TrxR și induc niveluri ROS mai mari. Celulele A, B: K562 și KU812 CML au fost tratate fie cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Activitatea TrxR a fost apoi măsurată utilizând un test colorimetric bazat pe DTNB și activitatea a fost făcută în raport cu proteina totală. Celulele CML, C: K562 și KU812 au fost tratate fie cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Nivelurile ROS au fost apoi măsurate utilizând o analiză fluorogenă H2DCFDA. Rezultatele au fost făcute în raport cu numărul total de celule. E - H: Ambele linii celulare au fost tratate cu auranofină sau [Au (d2pype) 2] Cl și cu sau fără BSO timp de 24 de ore, după care s-a efectuat un test de proliferare MTT. Rezultatele au fost analizate cu teste T multiple. În figurile A - D testele statistice au comparat rezultatele celulelor netratate și tratate. În figurile E - H testele statistice au comparat celulele tratate cu sau fără BSO. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Inhibitorii TrxR reduc expresia ARNm și proteine ​​a căii Bcr-abl. Celulele CML A, B: K562 și KU812 au fost tratate cu 4 uM fie de auranofină, fie de [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. RT-qPCR a fost apoi utilizat pentru a măsura nivelurile de expresie ale ARNm ale bcr-abl și MYC. RPL32 a fost utilizat ca normalizator Celulele CML, D: K562 și KU812 respectiv au fost tratate cu 4 uM fie de auranofină, fie de [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Western blot a fost apoi folosit pentru a măsura nivelurile de proteine ​​bcr-abl și MYC. Celulele CML E, F: K562 și KU812 au fost tratate fie cu 4 uM de auranofină, fie cu 8 uM [Au (d2pype) 2] Cl în celulele K562 și 4 uM de inhibitori în celulele KU812 timp de 24 de ore. Western blot a fost apoi folosit pentru a măsura nivelurile de p-AKT1 și AKT1. Vinculin și tub-tubulin au fost utilizate ca controale de încărcare pentru western blots. Rezultatele RT-qPCR au fost analizate cu mai multe teste T. Testele statistice au comparat rezultatele celulelor tratate și netratate. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

TrxR1 Knockdown Reduce Bcr-abl și c-myc mARN și expresia proteinelor. Celulele K562 au fost transfectate cu siRNA specific TrxR1 și un control siRNA amestecat. A: Viabilitatea celulei a fost apoi măsurată după 24 de ore. B: RT-qPCR a fost efectuat la 24 de ore după transfecție pentru a măsura nivelurile de expresie ale ARNm ale TrxR1, bcr-abl și MYC. RPL32 a fost utilizat ca normalizator C: Western blot a fost efectuat la 48 de ore după transfecție și a fost utilizat pentru a măsura nivelurile de proteine ​​ale TrxR1, bcr-abl și MYC. Β-tubulina a fost utilizată ca control de încărcare pentru western blots. Este prezentat un reprezentant de 3 pete. Rezultatele RT-qPCR și viabilitatea celulei au fost analizate cu teste T multiple. Testele statistice au comparat rezultatele celulelor TrxR1 doborâte și ale controlului siRNA amestecat. * = p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Celulele CML rezistente la imatinib au ARNm reglat în sus și expresie proteică a sistemului Trx. A, B: nivelurile de expresie ale ARNm ale Nrf2, Trx1, TrxR1 și TXNIP au fost măsurate folosind RT-qPCR în celule sensibile și rezistente K562 și respectiv KU812 CML, celulele sensibile fiind utilizate ca control. RPL32 a fost folosit ca normalizator. C, D: Nivelurile de proteine ​​ale Trx1 au fost măsurate în celulele CML sensibile și rezistente K562 și respectiv KU812. B-tubulina a fost utilizată ca control de încărcare. E, F: Analiza bazei de date a nivelurilor de expresie a ARNm ale Trx1 și respectiv TXNIP au fost comparate cu eșantioane de la pacienții cu LMC care au prezentat un răspuns la imatinib și la cei care nu (GSE2535). Rezultatele RT-qPCR au fost analizate prin ANOVA bidirecționale cu testul post hoc al lui Dunnett. Rezultatele analizei bazei de date au fost analizate printr-un test T nepereche. Testele statistice au comparat rezultatele dintre liniile celulare sensibile și rezistente. * = p p p p N = 3 pentru RT-qPCR și western blot, N = 16 pentru bioinformatică. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Celulele CML rezistente la imatinib sunt susceptibile la inhibitorii TrxR. A - F: Celulele K562 și KU812 sensibile și rezistente au fost tratate fie cu imatinib (A, B), cu auranofină (C, D), fie cu [Au (d2pype) 2] Cl (E, F) timp de 48 de ore. După toate aceste perioade de tratament s-au efectuat teste de proliferare MTT. G, H: Testele de activitate Caspase-3 au fost efectuate pe celule K562 și KU812 sensibile și rezistente după 24 ore de tratament fie cu imatinib, cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl. Testele de activitate I, J: TrxR au fost efectuate pe celule K562 și KU812 sensibile și rezistente după 24 ore de tratament fie cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl. Rezultatele au fost analizate prin ANOVA bidirecționale cu un test post hoc Dunnett. Testele statistice au comparat rezultatele dintre liniile celulare sensibile și rezistente. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Abstract

gratuit

Inhibitorii TrxR reduc creșterea celulară și determină apoptoza în celulele CML. A-D: Celulele K562 și KU812 au fost tratate cu auranofină (A, B) și [Au (d2pype) 2] Cl (C, D), timp de 24 și 48 de ore. Creșterea celulară a fost apoi măsurată utilizând testul de proliferare MTT. E, F: K562 și respectiv KU812 au fost tratați cu auranofină sau [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore, apoi s-a măsurat activitatea caspazei-3, utilizând un test fluorogenic pe bază de Ac-DEVD-AMC. G, H: Ambele linii celulare au fost tratate cu 4 uM de Auranofin sau [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Western blot a fost efectuată folosind un anticorp specific pentru PARk-1 (C-PARP) de 89kDa scindat. T-Tubulin a fost utilizat ca control de încărcare. Rezultatele MTT au fost analizate prin ANOVA bidirecțional cu testul post hoc al lui Dunnett. Activitatea Caspase-3 a fost analizată cu mai multe teste T. Testele statistice au comparat datele din celulele tratate și netratate. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Inhibitorii TrxR scad activitatea TrxR și induc niveluri ROS mai mari. Celulele A, B: K562 și KU812 CML au fost tratate fie cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Activitatea TrxR a fost apoi măsurată utilizând un test colorimetric bazat pe DTNB și activitatea a fost făcută în raport cu proteina totală. Celulele CML, C: K562 și KU812 au fost tratate fie cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Nivelurile ROS au fost apoi măsurate utilizând o analiză fluorogenă H2DCFDA. Rezultatele au fost făcute în raport cu numărul total de celule. E - H: Ambele linii celulare au fost tratate cu auranofină sau [Au (d2pype) 2] Cl și cu sau fără BSO timp de 24 de ore, după care s-a efectuat un test de proliferare MTT. Rezultatele au fost analizate cu teste T multiple. În figurile A - D testele statistice au comparat rezultatele celulelor netratate și tratate. În figurile E - H testele statistice au comparat celulele tratate cu sau fără BSO. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Inhibitorii TrxR reduc expresia ARNm și proteine ​​a căii Bcr-abl. Celulele CML A, B: K562 și KU812 au fost tratate cu 4 uM fie de auranofină, fie de [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. RT-qPCR a fost apoi utilizat pentru a măsura nivelurile de expresie ale ARNm ale bcr-abl și MYC. RPL32 a fost utilizat ca normalizator Celulele CML, D: K562 și KU812 respectiv au fost tratate cu 4 uM fie de auranofină, fie de [Au (d2pype) 2] Cl timp de 24 de ore. Western blot a fost apoi folosit pentru a măsura nivelurile de proteine ​​bcr-abl și MYC. Celulele CML E, F: K562 și KU812 au fost tratate fie cu 4 uM de auranofină, fie cu 8 uM [Au (d2pype) 2] Cl în celulele K562 și 4 uM de inhibitori în celulele KU812 timp de 24 de ore. Western blot a fost apoi folosit pentru a măsura nivelurile de p-AKT1 și AKT1. Vinculin și tub-tubulin au fost utilizate ca controale de încărcare pentru western blots. Rezultatele RT-qPCR au fost analizate cu mai multe teste T. Testele statistice au comparat rezultatele celulelor tratate și netratate. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

TrxR1 Knockdown Reduce Bcr-abl și c-myc mARN și expresia proteinelor. Celulele K562 au fost transfectate cu siRNA specific TrxR1 și un control siRNA amestecat. A: Viabilitatea celulei a fost apoi măsurată după 24 de ore. B: RT-qPCR a fost efectuat la 24 de ore după transfecție pentru a măsura nivelurile de expresie ale ARNm ale TrxR1, bcr-abl și MYC. RPL32 a fost utilizat ca normalizator C: Western blot a fost efectuat la 48 de ore după transfecție și a fost utilizat pentru a măsura nivelurile de proteine ​​ale TrxR1, bcr-abl și MYC. Β-tubulina a fost utilizată ca control de încărcare pentru western blots. Este prezentat un reprezentant de 3 pete. Rezultatele RT-qPCR și viabilitatea celulei au fost analizate cu teste T multiple. Testele statistice au comparat rezultatele celulelor TrxR1 doborâte și ale controlului siRNA amestecat. * = p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Celulele CML rezistente la imatinib au ARNm reglat în sus și expresie proteică a sistemului Trx. A, B: nivelurile de expresie ale ARNm ale Nrf2, Trx1, TrxR1 și TXNIP au fost măsurate folosind RT-qPCR în celule sensibile și rezistente K562 și respectiv KU812 CML, celulele sensibile fiind utilizate ca control. RPL32 a fost folosit ca normalizator. C, D: Nivelurile de proteine ​​ale Trx1 au fost măsurate în celulele CML sensibile și rezistente K562 și respectiv KU812. B-tubulina a fost utilizată ca control de încărcare. E, F: Analiza bazei de date a nivelurilor de expresie a ARNm ale Trx1 și respectiv TXNIP au fost comparate cu eșantioane de la pacienții cu LMC care au prezentat un răspuns la imatinib și la cei care nu (GSE2535). Rezultatele RT-qPCR au fost analizate prin ANOVA bidirecționale cu testul post hoc al lui Dunnett. Rezultatele analizei bazei de date au fost analizate printr-un test T nepereche. Testele statistice au comparat rezultatele dintre liniile celulare sensibile și rezistente. * = p p p p N = 3 pentru RT-qPCR și western blot, N = 16 pentru bioinformatică. Valorile afișate ca medie ± SEM.

Celulele CML rezistente la imatinib sunt susceptibile la inhibitorii TrxR. A - F: Celulele K562 și KU812 sensibile și rezistente au fost tratate fie cu imatinib (A, B), cu auranofină (C, D), fie cu [Au (d2pype) 2] Cl (E, F) timp de 48 de ore. După toate aceste perioade de tratament s-au efectuat teste de proliferare MTT. G, H: Testele de activitate Caspase-3 au fost efectuate pe celule K562 și KU812 sensibile și rezistente după 24 ore de tratament fie cu imatinib, cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl. Testele de activitate I, J: TrxR au fost efectuate pe celule K562 și KU812 sensibile și rezistente după 24 ore de tratament fie cu auranofină, fie cu [Au (d2pype) 2] Cl. Rezultatele au fost analizate prin ANOVA bidirecționale cu un test post hoc Dunnett. Testele statistice au comparat rezultatele dintre liniile celulare sensibile și rezistente. * = p p p p N = 3. Valorile afișate ca medie ± SEM.