Abstract

Apolipoproteina E (apoE) este o proteină de 34 kDa găsită în plasmă asociată cu mai multe clase de lipoproteine ​​cu funcție primară în colesterol și transportul lipidelor (1). Este exprimat în majoritatea tipurilor de celule, inclusiv hepatocite, mușchi netezi, macrofage, adipocite și sistemul nervos central (1). În plus față de facilitarea transportului lipidelor între diferite țesuturi și organe, apoE are, de asemenea, transportul lipidelor - funcții independente, cum ar fi modularea semnalizării celulare, oxidarea și activarea enzimei (2). Atât funcțiile dependente de transportul lipidelor, cât și cele independente ale apoE pot modula progresia și severitatea unui spectru larg de boli metabolice. Gena APOE umană există cu trei alele polimorfe majore. Cea mai comună alelă, cu o frecvență de ~ 75%, este ε3, care conferă beneficii metabolice datorită proprietăților antiinflamatorii și antioxidante ale apoE3. Alela ε4, cu o frecvență de ± 15%, codifică apoE4, care este proinflamator și crește astfel riscul atât pentru boli cardiovasculare, cât și pentru tulburări neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer (1,2).

indusă

Relația dintre alela ε2 și riscul bolilor metabolice este mai puțin clară. De obicei, purtătorii ε2 au niveluri mai scăzute de colesterol plasmatic (3), dar tind să aibă niveluri mai ridicate de trigliceride plasmatice și sunt predispuși la apariția dislipoproteinemiei de tip III (3,4), punându-i pe aceștia la un risc mai mare de boli asociate metabolismului. Deși mai multe studii independente nu au reușit să identifice o asociere între mutația ε2 și riscul de diabet de tip 2 (5-8), studiile genetice efectuate pe alte două populații au relevat asocierea alelei ε2 cu un IMC mai mare (odds ratio 3,55) și circumferința taliei. (raport de cote 3.3) (4.9). O meta-analiză la scară largă care combina date din 30 de studii independente a arătat că purtătorii ε2 prezintă un risc crescut moderat de a dezvolta diabet de tip 2 (10). Purtătorii ε2 diabetici au, de asemenea, un risc crescut și o severitate dublă a bolii coronariene comparativ cu ε3 pacienți cu diabet zaharat (11,12). La pacienții fără diabet, alela ε2 este un factor de risc independent pentru boala renală în stadiul final, bolile vasculare periferice, cum ar fi bolile cerebrovasculare și ischemia arterelor extremităților inferioare și ateroscleroza carotidă (13-16). Mecanismul (mecanismele) care stau la baza contribuției apoE2 la obezitate, diabet și boli vasculare periferice nu a fost elucidat.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Animale și diete.

Șoarecii de înlocuire genică, la care gena endogenă apoE a șoarecelui a fost înlocuită în același locus cu gena APOE2 sau APOE3 umană (24,25), denumiți în continuare șoareci APOE2 și APOE3, au fost achiziționați de la Taconic (Hudson, NY), de unde au fost încrucișate la fundalul C57BL/6 prin nouă și, respectiv, opt generații. Genotipurile APOE umane la aceste animale au fost confirmate prin izotipare de restricție după amplificarea genei, așa cum s-a descris anterior (26). Șoarecii au fost hrăniți fie cu chow (Teklad, Madison, WI), fie cu o dietă de tip occidental, bogată în grăsimi, cu conținut ridicat de colesterol, conținând 21,2% grăsimi și 0,2% colesterol (TD88137; Teklad). Animalele au fost întreținute în condiții de mediu controlate, cu acces gratuit la alimente și apă. Toate protocoalele pentru animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de utilizare și îngrijire a animalelor de la Universitatea din Cincinnati.

Măsurători ale greutății și adipozității.

Șoarecii APOE2 și APOE3 potrivite pentru vârstă au fost adăpostiți în funcție de genotipul lor cu unu până la trei șoareci pe cușcă. Consumul de alimente a fost monitorizat zilnic pe o perioadă de o săptămână. Nu s-a observat nicio diferență evidentă în cantitățile medii de alimente consumate per animal, indiferent de condițiile de adăpostire. Măsurătorile greutății corporale și adipozității au fost efectuate la fiecare 2 săptămâni. Greutățile au fost obținute folosind o scară Denver 300 K. Măsurătorile adipozității au fost obținute utilizând un analizor al compoziției întregului corp EchoMRI (Echo Medical Systems, Houston, TX), așa cum a fost descris anterior (27).

Chimia sângelui.

Sângele a fost colectat de la șoareci după un post peste noapte. Glicemia a fost determinată cu un glucometru activ Accu-Check (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate cu setul ELISA de insulină de șobolan ultra sensibil (Crystal Chem, Chicago, IL). Nivelurile de adiponectină plasmatică au fost măsurate cu Adiponectină de șoarece/Acrp30 DuoSet ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Nivelurile plasmatice de leptină și alte citokine au fost determinate folosind MILLIPLEX MAP Mouse Adipokine Panel (Millipore, St. Charles, MO). Colesterolul plasmatic și trigliceridele au fost determinate folosind seturi de colesterol și trigliceride Infinity (Thermo Fisher Scientific, Middletown, NJ). Probele de la fiecare șoarece au fost analizate individual, cu excepția separării lipoproteinelor, în care două probe grupate separat, fiecare cu 0,25 ml de plasmă de la trei animale din fiecare grup, au fost supuse filtrării cu gel de cromatografie lichidă cu performanță rapidă (FPLC) pe două coloane Superose 6 conectate în serie. Fracțiunile individuale din FPLC au fost analizate pe baza conținutului de colesterol și prin analiza Western blot cu apoB anti-capră apoB (Millipore) și anticorpi anti-apoE anti-om de iepure (Dako) la 1: 5.000 diluții, așa cum s-a descris anterior (28).

Clearance lipidic postprandial.

Șoarecii au fost postiti peste noapte și apoi au fost hrăniți cu o masă bogată în lipide în bolus (15 uL ulei de măsline și 0,2 uCi [14 C] trioleină pe gram greutate corporală) prin gavaj stomacal. Sângele (50 uL) a fost obținut din vena cozii înainte și 15, 30, 60, 120 și 180 de minute după aceea. Plasma a fost obținută după centrifugare și utilizată pentru măsurarea nivelurilor de trigliceride și determinarea radioactivității prin numărarea scintilației lichide.

Teste de toleranță la glucoză și sensibilitate la insulină.

O soluție de glucoză a fost administrată pe cale orală prin gavajul stomacului la șoareci APOE2 și APOE3 hrăniți cu chow (2 g/kg greutate corporală) după un post peste noapte. Sensibilitatea la insulină a fost monitorizată prin injecție intraperitoneală de 0,75 unități de insulină de porc pe gram de greutate corporală după un post de 10 ore. Sângele a fost obținut din vena cozii înainte și la fiecare 15 minute după administrarea de glucoză sau insulină pentru a măsura nivelurile de glucoză.

Histologia țesutului adipos.

Țesuturile adipoase subcutanate (inghinale) și viscerale (gonadale) au fost fixate în soluții izotonice neutre de 4% paraformaldehidă înainte de înglobare în parafină. Trei secțiuni de 5 secțiuni de la niveluri diferite ale fiecărui depozit obținute de la fiecare șoarece (patru șoareci APOE2 și șase șoareci APOE3) au fost analizate pentru dimensiunea adipocitelor și structurile asemănătoare coroanei după colorare cu hematoxilină și eozină. Dimensiunile adipocitelor au fost determinate ca suprafață adipocitară de 480 adipocite aleatorii. Structurile asemănătoare coroanei, indicative ale macrofagelor inflamatorii din jurul adipocitelor moarte (29), au fost identificate pe baza agregatelor de celule nucleate care înconjoară adipocitele individuale. Densitatea structurii asemănătoare coroanei a fost obținută prin numărarea numărului total din fiecare secțiune în comparație cu numărul total de adipocite.

Cuantificarea ARN-ului.

ARN-ul total a fost izolat cu reactiv TRIzol (Invitrogen) și tratat cu Turbo DNază (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX). ADNc a fost generat utilizând kitul de sinteză iScript cADN (Laboratoare Bio-Rad, Hercules, CA). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată pe un termociclator rapid StepOnePlus folosind Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) cu secvențe de primer așa cum se arată în Tabelul 1.

Exemple de secvențe utilizate pentru amplificarea RT-PCR a ARN-ului

Citometrie în flux.

Statistici.

Analizele statistice au fost efectuate folosind foaia de calcul Microsoft Excel sau software-ul SigmaPlot versiunea 11.0. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SD, cu excepția cazului în care se indică în legenda figurii. Diferențele au fost considerate semnificative la P 14 C] trioleină, clearance-ul plasmatic întârziat al lipidelor radiomarcate, indicativ al clearance-ului deficient al lipoproteinelor bogate în trigliceride, a fost observat la șoarecii APOE2 (Fig. 1C). Clearance-ul afectat al lipoproteinelor postprandiale, bogate în trigliceride, a condus la hiperlipidemie postprandială robustă la șoarecii APOE2 (Fig. 1D). Analiza lipoproteinelor la șoareci hrăniți cu dieta chow și occidentală, atât în ​​condiții de post cât și postprandiale, prin FPLC a relevat acumularea de VLDL și LDL la șoarecii APOE2 (Fig. 1E și F). Analiza Western blot a confirmat acumularea de lipoproteine ​​care conțin apoB100 și apoB48 cu apoE în exces la șoareci APOE2 comparativ cu șoareci APOE3 (Fig. 1E și F). Aceste rezultate au arătat că șoarecii APOE2 au recapitulat metabolismul anormal al lipoproteinelor la ε2 subiecți umani și, astfel, pot fi utilizați pentru a evalua influența apoE2 asupra bolilor metabolice.

Nivelurile lipidice plasmatice la șoarecii APOE2 și APOE3. A: Niveluri de trigliceride în post. B: Nivelurile de colesterol postind la șoarecii APOE2 și APOE3 hrăniți cu dieta chow (bare umplute) și după hrănirea dietei de tip occidental timp de 4 săptămâni (bare deschise). Barele cu litere diferite au fost diferite la P 14 C] lipide din plasmă după hrănirea șoarecilor APOE2 (simboluri deschise) și APOE3 (simboluri umplute) cu o masă de ulei de măsline conținând [14 C] trioleină. D: Nivelurile trigliceridelor plasmatice postprandiale în APOE2 (simboluri deschise) și APOE3 (simboluri umplute) hrănite cu chow la 2 ore după alimentarea orală a unei mese bogate în lipide. Datele din C și D reprezintă media ± SD de la patru șoareci din fiecare grup, cu * și # indicând diferențe semnificative față de șoarecii APOE3 la granulocitele P + Ly6G + sau granulocite ale NOS2 inductibil comparativ cu șoarecii APOE3, un număr semnificativ mai mare al ambilor Granulocitele NOS2 + și CD11b + Ly6G + au fost observate la șoareci APOE2 în perioada postprandială comparativ cu cele observate la șoareci APOE3 (Fig. 2G și H).