Lucrare de cercetare

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

ABSTRACT

Obezitatea a devenit o amenințare globală pentru sănătate pentru fiecare grupă de vârstă. Este bine cunoscut faptul că șoarecii tineri (cu vârsta de 10-12 săptămâni) hrăniți cu o dietă de tip occidental (WD) devin obezi și dezvoltă niveluri mai ridicate de colesterol și steatoză hepatică, în timp ce sensibilitatea la insulină este redusă. Cu toate acestea, se știe mai puțin despre efectul unei WD asupra șoarecilor în vârstă. Prin urmare, șoarecii masculi C57BL/6JRj de 10 săptămâni (tineri) și 22 de luni (vârstă înaintată) au fost ținuți fie pe o dietă WD, fie pe o dietă de control (SFD) timp de 15 săptămâni. Spre deosebire de șoarecii tineri, șoarecii de vârstă avansată pe WD nu au prezentat o greutate corporală mai mare sau țesut adipos (AT), sugerând o protecție împotriva obezității induse de dietă. Mai mult, nivelurile plasmatice de adiponectină și leptină nu au fost afectate la alimentarea cu WD. Un WD, cu toate acestea, a indus o acumulare mai mare de lipide hepatice, precum și o expresie hepatică crescută a markerului macrofagului F4/80, la șoarecii în vârstă. Nu au existat diferențe semnificative în nivelurile de ARNm ale proteinei-1 sau F4/80 de decuplare în AT maro (BAT) sau a mai multor markeri de integritate intestinală din colon, sugerând că protecția împotriva obezității nu se datorează BAT excesive sau absorbției intestinale a grăsimilor . Astfel, șoarecii în vârstă, spre deosebire de omologii lor mai tineri, păreau a fi protejați împotriva obezității induse de dietă.

șoarecii

Introducere

Materiale și metode

Model animal

Publicat online:

Tabelul 1. Compoziția dietelor.

Analize

Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate utilizând benzi Glucocard (28.350, Menarini Diagnostics), iar trigliceridele plasmatice și colesterolul au fost evaluate utilizând teste clinice de rutină. Nivelurile de insulină plasmatică (Mercodia), adiponectină (sisteme R&D) și leptină (sisteme DY498, sisteme R&D) au fost măsurate utilizând ELISA disponibile în comerț. Indicele modelului homeostatic al rezistenței la insulină (HOMA-IR-) a fost calculat după cum urmează: nivelurile de glucoză la jeun (mM) x nivelurile de insulină la jeun (mU/L)/22,5. Conținutul de trigliceride din ficat și BAT a fost cuantificat cu kitul trigliceridelor FS * (Diasys), după prepararea țesutului hepatic așa cum s-a descris anterior [6]. Pe scurt, 30 mg țesut a fost incubat peste noapte la 55 ° C în KOH alcoolic (2: 3 60 ml EtOH 99% + 30 ml 30% KOH) până când digestia a fost completă. A doua zi, s-a adăugat 1 M MgCl2 (1: 1, vol/vol) la probele digerate. După 10 minute de incubație pe gheață și centrifugarea ulterioară, supernatantul a fost aspirat și analizat folosind kitul trigliceridelor FS * (Diasys). Nivelurile de lactat dehidrogenază (LDH) au fost evaluate utilizând setul de testare LDH (Abcam) conform instrucțiunilor producătorului.

Western blot

O Western blot pentru decuplarea proteinei-1 (UCP-1) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [7]. Pe scurt, țesutul adipos BAT a fost omogenizat utilizând ribolizorul FastPrep (MP Biomedicals) într-un tampon format din fosfat Na 10 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, 1% Triton, 0,1% dodecil sulfat de sodiu (SDS), 0,5% Na deoxicolat, 0,2 % NaN3 și un cocktail inhibitor de protează (Thermo Fischer Scientific). Testul proteinei BCA (Pierce) a fost utilizat pentru a determina concentrația de proteine. O cantitate egală de proteină a fost apoi încărcată pe un SDS-PAGE de 10%. Gelurile au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză de 0,45 μm și blocate în lapte uscat fără grăsimi 5% (Bio-Rad) în tampon Tris-HCl 10 mM cu NaCl 150 mM și 0,5% Tween 20 pH 7,6 timp de 3 ore. În continuare, membrana a fost sondată cu un anticorp UCP-1 (Sigma-Aldrich). Pentru controlul încărcării, a fost utilizată β-actina. S-a adăugat apoi un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean în TBST care conține 5% lapte uscat fără grăsime. Semnalele au fost detectate folosind chemiluminescență îmbunătățită (Thermo Fischer Scientific). Analiza a fost efectuată cu imaginea J (NIH).

PCR în timp real

Testele de expresie a genei TaqMan (Thermo Fischer Scientific Inc.) au fost utilizate pentru a analiza nivelurile de ARNm ale mai multor gene din țesutul ficatului și colonului și BAT prin RT-PCR cantitativă (Tabelul 2), conform unui protocol descris anterior [8]. Pe scurt, extracția ARN din țesuturi a fost efectuată folosind mini kitul RNeasy (Qiagen, Basel, Elveția) conform instrucțiunilor producătorului. Zece nanograme/microlitru ARN au fost transcrise invers în ADNc folosind kitul Multiscribe ™ Reverse Transcriptase (Life Technologies, Thermo Fischer Scientific Inc.) conform protocolului producătorului. Detectorul de secvență rapidă ABI 7500 a fost utilizat pentru a efectua RT-PCR cantitativ. Datele au fost obținute ca valori ale pragului de ciclu (Ct) și normalizate la gena de menaj β-actină (∆Ct = Cttarget - Ctβ-actină). Pentru fiecare genă, au fost analizate două probe și valoarea medie Ct a fost calculată și utilizată pentru analiză. Diferențele de pliere în expresia genelor au fost calculate cu metoda ΔΔCt, folosind șoareci C57BL/6J păstrați pe SFD ca calibrator.

Publicat online:

Tabelul 2. Markeri detectați prin qPCR folosind teste de expresie a genei TaqMan.

Histologie și microscopie

Probele de grăsime și ficat SC, GN și MES au fost fixate timp de 72 de ore în 4% formaldehidă, spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat și parafină încorporate. Ulterior, secțiunile de 7 μm pentru grăsimi și secțiunile de 4 μm pentru țesuturile hepatice au fost deparafinizate și colorate cu hematoxilină/eozină (H&E). Imagini ale secțiunilor de grăsime și ficat colorate cu H & E au fost obținute utilizând un microscop Zeiss inversat 200M Zeiss cu lumină normală și Axiovision Rel. 4.8.2 (Zeiss) la mărire x100. Mărimea și densitatea adipocitelor au fost apoi determinate pe secțiuni de grăsime colorate cu H & E așa cum s-a descris anterior [9]. Pe scurt, au fost calculate 10 zone pentru fiecare mouse folosind un analizor computerizat de imagine. Ulterior, sa presupus că morfometria sferică calculează suprafața celulei. Steatoza hepatică a fost evaluată pe secțiunile hepatice colorate cu H & E, așa cum sa raportat anterior [10].

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca medii ± SEM pentru numărul de animale studiate. Diferențele dintre grupuri au fost analizate folosind testul Mann-Whitney-U. Valorile p 11-14], am constatat că după 15 săptămâni de expunere la dietă șoarecii tineri hrăniți cu WD au cântărit semnificativ mai mult comparativ cu șoarecii martor hrăniți cu SFD (p Șoarecii cu vârstă avansată C57BL/6JRj nu dezvoltă obezitate la expunerea la dieta de tip occidental

Publicat online:

Tabelul 3. Greutatea corporală și greutățile organelor.

Publicat online:

Tabelul 4. Parametrii metabolici.

Publicat online:
Publicat online:

Figura 2. Nici o diferență în expresia relativă a Ucp-1 și F4/80 în BAT și Occln, Zo-1 și Zon în colonul șoarecilor în vârstă. (a) Concentrația trigliceridelor în țesutul adipos maro. (b-c) Expresia relativă a Ucp-1 (B) și F4/80 (C) în BAT. (d - f) Expresia relativă a Occln (D), Zo-1 (E) și Zon (F) în colon. ° = p Figura 2. Nici o diferență în expresia relativă a Ucp-1 și F4/80 în BAT și Occln, Zo-1 și Zon în colonul șoarecilor de vârstă avansată. (a) Concentrația trigliceridelor în țesutul adipos maro. (b-c) Expresia relativă a Ucp-1 (B) și F4/80 (C) în BAT. (d - f) Expresia relativă a Occln (D), Zo-1 (E) și Zon (F) în colon. ° = p 50% carbohidrați sau proteine. Prin urmare, cantitatea de grăsimi și carbohidrați din dieta noastră de control este încă de 30%. Acest lucru ar putea explica de ce șoarecii care au alimentat dieta de control au atins greutăți corporale atât de mari. O altă explicație pentru care șoarecii martori ating greutăți corporale destul de mari ar putea fi că, deoarece dieta noastră de control constă în 40% proteine, șoarecii dezvoltă mase musculare mai mari.

Odată cu vârsta, adipozitatea crește treptat la oameni, cu o acumulare preferențială de grăsime viscerală și o scădere a grăsimii subcutanate [15]. Studiile au arătat că șoarecii homozigoti C57BL/6J Clock Δ19 mutant, un model murin conceput pentru a studia îmbătrânirea, dezvoltă obezitate [16]. Mai mult, greutatea corporală a șoarecilor C57BL/6JRj de îmbătrânire naturală crește până la 12 luni urmată de o scădere de până la 24 de luni [5]. Acest lucru ar putea explica de ce, în studiul nostru, șoarecii în vârstă nu dezvoltă obezitate la expunerea la dieta occidentală.

Pettan-Brewer și Treuting au descoperit că într-o colonie de șoareci C57BL/6J, 17% dintre șoarecii în vârstă au prezentat veziculită seminală [17]. Deoarece am vrut să anticipăm riscul de deces prematur datorită acestei rate mai ridicate de dezvoltare a comorbidităților legate de vârstă, am ales n = 10 pentru șoarecii în vârstă. Pentru șoarecii tineri, am decis n = 5, deoarece studiile anterioare efectuate în laboratorul nostru și literatura existentă au arătat că un WD induce obezitatea la șoarecii tineri adulți. Mai mult, ne așteptam ca variabilitatea să fie mult mai mică în acest grup, deoarece acestea dezvoltă rareori comorbidități. Într-adevăr, în studiul nostru, câțiva șoareci din grupul de vârstă avansată au prezentat decolorarea glandelor seminale, sugerând veziculită (date neprezentate) și niveluri mai ridicate de plasmă LDH. LDH este un marker surogat pentru deteriorarea organelor. Prin urmare, propunem că șoarecii în vârstă ar putea avea nevoie de energia suplimentară furnizată de dieta occidentală pentru a combate dezvoltarea comorbidităților legate de vârstă. Pentru a evalua în mod adecvat cheltuielile de energie, ar fi necesar un nou studiu care utilizează cuști metabolice.

Deoarece șoarecii mai tineri expuși la o dietă occidentală dezvoltă obezitate, ar fi foarte interesant să urmărim efectele unei expuneri pe termen lung la WD, de la 10 săptămâni până la 24 de luni.

Îmbătrânirea la om este asociată cu hiperglicemie [18], hiperinsulinemie [18], hipercolesterolemie [19] și afectarea funcției hepatice [20]. Cu toate acestea, centenarii au niveluri mult mai mici de glucoză plasmatică și insulină, sugerând că au o sensibilitate mai bună la insulină în comparație cu persoanele mai tinere [21, 22]. În studiul lui Hemmeryckx și colab., Șoarecii de 24 de luni au prezentat niveluri plasmatice semnificativ mai scăzute de insulină și glucoză în comparație cu omologii lor de 12 luni și 10 săptămâni, sugerând o sensibilitate îmbunătățită la insulină [5]. În prezentul studiu am constatat că expunerea la WD a șoarecilor în vârstă de 22 de luni nu a modificat nivelurile de insulină și glucoză din plasmă, rezultând un indice HOMA similar care sugerează că la bătrânețe, expunerea la WD nu induce rezistență la insulină.

Aceste rezultate sunt contradictorii cu ceea ce este cunoscut pentru animalele tinere. În studiul lui Surwit și colab., Hrănirea cu WD a dus la o greutate corporală crescută, însoțită de hiperglicemie și hiperinsulinemie în repaus alimentar [2]. Cu toate acestea, în prezentul studiu, nu am reușit să confirmăm rezistența la insulină indusă de un WD. Acest lucru se poate datora diferențelor genetice și fenotipice dintre sub-tulpinile C57BL/6 în ceea ce privește capacitatea de reacție la un HFD [23].

Am observat că masa BAT a fost mărită la o încărcare WD de 15 săptămâni a șoarecilor C57BL/6JRj în vârstă. Acest lucru nu s-a datorat doar unei acumulări crescute de lipide. Peterson și colab. De asemenea, a raportat că greutatea BAT a crescut odată cu vârsta la bărbații, dar nu la șoarecii C57BL/6J femele proporțional cu schimbarea greutății corporale cu vârsta [24]. Încărcarea pe termen scurt a grăsimii la șoarecii C57BL/6J adulți de 10 săptămâni s-a dovedit anterior că sporește potențialul de ardere a acidului gras al BAT, în timp ce obezitatea morbidă stabilită după expunerea pe termen lung la un HFD face ca BAT să nu răspundă la grăsime [23]. Îmbătrânirea în sine nu influențează numărul de macrofage F4/80-pozitive; cu toate acestea, expunerea șoarecilor adulți C57BL/6J la un HFD timp de 8 săptămâni a dus la o reducere a macrofagelor în BAT obeze [25]. Mai mult, la om, îmbătrânirea este asociată cu o reducere a masei și activității BAT [26]. Cu toate acestea, în studiul nostru, analiza nivelurilor de ARNm de UCP1 și F4/80 nu a relevat nicio diferență semnificativă între șoarecii de vârstă avansată, păstrați pe WD sau SFD, indicând faptul că, în acest studiu, acumularea excesivă de lipide în BAT sau acumularea de macrofage nu reprezintă Greutate BAT sau pentru protecție împotriva obezității induse de dietă.

În concluzie, am demonstrat că șoarecii în vârstă par să fie protejați împotriva obezității induse de dietă. Cu toate acestea, o dietă occidentală a provocat o acumulare crescută de lipide hepatice, precum și o creștere a expresiei hepatice F4/80, deși enzimele hepatice nu au fost afectate semnificativ. În general, aceste descoperiri pot fi relevante pentru anchetatorii care utilizează modele de obezitate sau îmbătrânire la șoareci.

Tabelul 1. Compoziția dietelor.

Compoziția detaliată a dietelor utilizate pentru experimente. SFD = dieta standard cu grăsimi, WD = dieta de tip occidental.