Abstract

Subfamilia Foxo a factorilor de transcripție a furcii, inclusiv Foxo1 (FKHR), Foxo3a (FKHRL-1) și Foxo4 (AFX), este o țintă din aval a Akt (20). Fosforilarea Akt are ca rezultat excluderea (inhibarea) nucleară a Foxo. În plus față de răspunsurile celulare bine stabilite provocate de Foxo, incluzând diferențierea, metabolismul, proliferarea, supraviețuirea și atrofia mușchilor scheletici (20, 37), acest factor de transcripție a fost indicat și în atrofia cardiomiocitelor care implică reglarea ascendentă a unei cascade de atrogene (36)., 37, 46). În mușchiul scheletic, atrogenele sunt controlate de reglarea transcripțională mediată de factorul de creștere a factorilor Foxo (35, 37). Recent, s-a demonstrat că factorii de transcripție Foxo sunt exprimați în cardiomiocite sub reglarea factorilor de creștere/semnalizare Akt. Foxo poate controla un program de transcripție atrogenă pentru a regla dimensiunea miocitelor în aval de mai mulți regulatori ai hipertrofiei cardiace (40).

Hrana cu conținut ridicat de grăsimi și parametrii serici.

Evaluarea ecocardiografică.

Geometria și funcția cardiacă au fost evaluate la șoareci anesteziați (Avertin 2,5%, 10 μl/g corp greutate ip) folosind ecocardiografie bidimensională în modul M (Phillips Sonos 5500) echipată cu un traductor liniar de 15-6 MHz (Phillips Medical Systems, Andover, MD). Grosimile peretelui anterior și posterior și dimensiunile diastolice și sistolice ale ventriculului stâng au fost înregistrate din imagini în modul M folosind o metodă adoptată de Societatea Americană de Ecocardiografie. Scurtarea fracțională a fost calculată din diametrul diastolic final (EDD) și diametrul sistolic final (ESD) utilizând ecuația (EDD-ESD)/EDD. Masa estimată a ventriculului stâng ecocardiografic (LV) a fost calculată ca [(LVEDD + grosimea peretelui septal + grosimea peretelui posterior) 3 - LVEDD 3] × 1,055, unde 1,055 (mg/mm 3) este densitatea miocardului. Ritmul cardiac a fost calculat în medie pe 10 cicluri cardiace (14).

Izolarea cardiomiocitelor.

După sedarea ketaminei/xilazinei, inimile au fost îndepărtate și perfuzate cu tampon bicarbonat Krebs-Henseleit conținând (în mM) următoarele: 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10 HEPES și 11,1 glucoză. Inimile au fost digerate cu colagenază D timp de 20 de minute. Ventriculele stângi au fost îndepărtați și tocați înainte de a fi filtrate. Randamentul miocitelor a fost de ~ 75%, ceea ce nu a fost afectat de alimentația bogată în grăsimi. Doar miocitele în formă de tijă cu margini limpezi au fost selectate pentru studiul mecanic și intracelular Ca 2+ (12).

Scurtarea și întărirea celulelor.

Proprietățile mecanice ale cardiomiocitelor au fost evaluate utilizând un sistem cu margini moi IonOptix (IonOptix, Milton, MA). Miocitele au fost plasate într-o cameră montată pe stadiul unui microscop Olympus IX-70 și superfuzate (± 2 ml/min la 25 ° C) cu un tampon de bicarbonat Krebs-Henseleit conținând 1 mM CaCl2. Miocitele au fost stimulate în câmp la 0,5 Hz, dacă nu se specifică altfel. Scurtarea și întărirea celulelor au fost evaluate, inclusiv scurtarea maximă (PS) - contractilitatea maximă; time-to-PS (TPS) - durata contracției; întărirea timpului până la 90% (TR90) - durata relaxării; și viteze maxime de scurtare/întărire (± dL/dt) - și dezvoltarea și declinul presiunii maxime (12).

Tranzitori intracelulari Ca 2+.

O cohortă de miocite a fost încărcată cu fura 2-AM (0,5 μM) timp de 10 min, iar intensitatea fluorescenței a fost înregistrată cu un sistem de fotomultiplicator cu fluorescență cu dublă excitație (Ionoptix). Miocitele au fost plasate pe un microscop inversat Olympus IX-70 și au fost realizate printr-un obiectiv Fluor × 40 cu ulei. Celulele au fost expuse la lumina emisă de o lampă de 75 W și au trecut fie printr-un filtru de 360, fie de 380 nm, în timp ce au fost stimulate să se contracte la 0,5 Hz. Emisiile de fluorescență au fost detectate între 480-520 nm, iar schimbarea calitativă a intensității fluorescenței fura 2 (FFI) a fost dedusă din raportul FFI la cele două lungimi de undă (360/380). Timpul de descompunere a fluorescenței (decădere unică sau bi-exponențială) a fost calculat ca indicator al compensării intracelulare a Ca 2+ (12).

Test Caspase-3.

Activitatea Caspase-3 a fost determinată conform metodei publicate (23). Pe scurt, s-a adăugat 1 ml PBS într-un balon care conține omogenate de țesut ventricular stâng înainte de centrifugare la 10.000 g la 4 ° C timp de 10 min. Supernatantul a fost aruncat și omogenizații au fost lizați în 100 pl de tampon de liză cu celule răcite cu gheață (50 mM HEPES pH 7,4, 0,1% CHAPS, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA și 0,1% NP-40). Testul a fost efectuat pe o placă cu 96 de godeuri, fiecare godeu conținând 30 μl de lizat celular, 70 μl de tampon de testare (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 100 mM NaCl, 10 mM DTT și 1 mM EDTA) și 20 μl de substrat colorimetric caspază-3 Ac-DEVD-pNA (Sigma). Placa cu 96 de godeuri a fost incubată la 37 ° C timp de 1 oră, timp în care caspaza din probă a fost lăsată să scindeze cromoforul p-NA din molecula substratului. Absorbția a fost detectată la 405 nm, activitatea caspazei-3 fiind proporțională cu reacția de culoare. Conținutul de proteine ​​a fost determinat folosind metoda Bradford. Activitatea caspazei-3 a fost exprimată ca picomoli de pNA eliberat pe micrograme de proteină pe minut.

Test Caspase-3/7.

Activitatea Caspase-3 și caspase-7 a fost determinată folosind un kit de testare omogenă Apo-ONE caspase-3/7 (Promega, Madison, WI). Caspaza-3 și caspaza-7 sunt membri ai familiei proteazei specifice acidului cisteină aspartic (caspază) care joacă roluri cheie în apoptoză în celulele mamiferelor. Pe scurt, activitățile de caspază-3 și caspază-7 au fost detectate în celulele supuse apoptozei prin clivarea unei rodamine 110, bis-N-Substrat al amidei acidului CBZ-1-aspartil-1-glutamil-1-valil-1-aspartic (Z-DEVD-R110), care există ca substrat profluorescent înainte de testare. Pentru a efectua testul Apo-ONE caspase-3/7, am amestecat și adăugat un tampon caspase-3/7 și substratul Z-DEVD-R110 la omogenizările de țesut ventricular stâng. După scindarea secvențială și îndepărtarea peptidelor DEVD prin activitatea caspazei-3 și caspazei-7, grupul părăsit R110 va deveni intens fluorescent la o lungime de undă de excitație de 499 nm și o lungime de undă de emisie de 521 nm. Activitatea caspazei-3 și caspazei-7 a fost direct proporțională cu fluorescența R110 și a fost exprimată ca fluorescență netă (2).

Transfecție Foxo3a dominantă-negativă ex vivo și analiză Western blot.

Extracția totală a ARN-ului, sinteza ADNc, transcrierea inversă și PCR în timp real.

Analiza datelor.

Datele sunt mijloace ± SE. Comparația statistică a fost efectuată de ANOVA urmată de teste post hoc Newman-Keuls. Semnificația a fost stabilită ca P

cardiomiopatia

FIG. 1.Efectul hrănirii dietei grase asupra apoptozei în ventriculii stângi ai șoarecilor din grupurile cu restricție alimentară cu conținut scăzut de grăsimi, cu conținut ridicat de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi (controlul greutății). A: activitate caspase-3. B: activitate capsază-3/7. Datele sunt mijloace ± SE; n = 5-6 șoareci per grup. *P

tabelul 1. Parametrii biometrici și ecocardiografici ai șoarecilor hrăniți cu o dietă scăzută sau bogată în grăsimi timp de 6 luni

Controlul în funcție de greutate este o restricție alimentară bogată în grăsimi. EDD, diametru end-diastolic; ESD, diametru sistolic final; VS, ventricular stâng. Datele sunt mijloace ± SE; n = nu. de animale.

* P † P 2+ proprietăți.

Obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi a fost însoțită de o creștere semnificativă a secțiunii transversale a cardiomiocitelor, redusă ± dL/dt, și TPS și TR90 prelungite cu PS normal (Fig. 2), oarecum amintește de constatările noastre anterioare (33). În plus, cardiomiocitele de la șoareci obezi cu conținut ridicat de grăsimi au prezentat o creștere semnificativă a valorii inițiale a Ca 2+ intracelulară, creșterea depresivă a Ca 2+ intracelulară ca răspuns la stimulul electric (rateFFI) și o rată de decadere intracelulară Ca 2+ redusă (fie unică, fie bi-exponențială potrivirea curbei; Fig. 3). Aceste cardiomiocite mecanice și defecte intracelulare Ca 2+ asociate cu obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi au fost semnificativ atenuate de manevra de control al greutății. Cu toate acestea, restricția alimentară a dietei cu conținut ridicat de grăsimi a prelungit ușor, dar semnificativ TR90 și descompunerea intracelulară ca 2+ ca intracelulară, fără a afecta alți indici (Fig.F și 3D).

FIG. 2.Proprietăți contractile ale cardiomiocitelor din grupurile cu restricție alimentară cu conținut scăzut de grăsimi, conținut ridicat de grăsimi și conținut ridicat de grăsimi (controlul greutății). A: zona de secțiune transversală. B: scurtarea vârfului (normalizată la lungimea celulei); C: viteza maximă de scurtare (+ dL/dt). D: viteza maximă de întărire (−dL/dt). E: scurtarea timpului până la vârf (TPS). F: întărirea timpului până la 90% (TR90). Datele sunt mijloace ± SE; n = 75 de celule de la 6 șoareci per grup. *P


FIG. 3.Tranzitori intracelulari Ca 2+ în cardiomiocite din grupuri cu restricție alimentară cu conținut scăzut de grăsimi, cu conținut ridicat de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi (controlul greutății). A: intensitatea fluorescenței în fura 2 de repaus (FFI). B: creșterea stimulată electric a FFI (ΔFFI). C: dezintegrare exponențială intracelulară Ca 2+ unică. D: descompunerea intracelulară bi-esponențială Ca 2+. Datele sunt mijloace ± SE; n = 60 de celule de la 6 șoareci per grup. *P

Exprimarea Akt, pAkt, Foxo3a, pFoxo3a, factori hipertrofici, MuRF-1 și atrogin-1.

Datele privind imunoblotarea au arătat că obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi a îmbunătățit semnificativ fosforilarea bazală a Akt și Foxo3a (prezentată ca fosforilare absolută sau normalizată) fără a afecta expresia totală a proteinelor Akt și Foxo3a. Mai mult, obezitatea asociată unei diete bogate în grăsimi a abrogat creșterea stimulată de insulină în fosforilarea Akt și Foxo3a (prezentată ca fosforilare absolută sau normalizată). Expunerea la insulină nu a afectat nivelurile de Akt și Foxo3a nefosforilate (Fig. 4). Datele noastre au mai dezvăluit că obezitatea indusă de o dietă bogată în grăsimi a redus semnificativ expresia transcripțională a atrogenilor, inclusiv MuRF-1 și atrogin-1. Ambii atrogeni au prezentat o scădere similară a expresiei ARNm de ~ 50%. În plus, markerii pentru hipertrofia GATA4 și CNTFR-α au fost în mod semnificativ reglați în inimile murine după 6 luni de hrană bogată în grăsimi. Cu toate acestea, nivelurile miocardice de calcineurină A și ubiquitină nu au fost afectate ca răspuns la 6 luni de dietă bogată în grăsimi (Fig. 5).

FIG. 4.Analiza Western blot a Akt și Foxo3a totale și fosforilate în cardiomiocite de la șoareci cu conținut scăzut de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi în absența sau prezența stimulării insulinei (1,5 U/100 g greutate corporală timp de 10 minute). A: total Акт. B: total Foxo3a. C: Akt fosforilat (pAkt). D: Foxo3a fosforilat (pFoxo3a). E: raport pAkt-toAkt. F: raportul pFoxo3a-la-Foxo3a. Insecte: geluri reprezentative ale Akt, pAkt, Foxo3a și pFoxo3a folosind anticorpi specifici. Datele sunt mijloace ± SE; n = 5-8 pe grup. *P


FIG. 5.A și B: Măsurarea RT-PCR a atroginei-1 (A) și degetul RING specific mușchilor (MuRF) (B) în ventriculii stângi de la șoareci cu conținut scăzut de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi. C și D: Analiza Western blot a proteinelor hipertrofice ale receptorului factorului neurotrofic ciliar (CNTFR) -αC) și GATA4 (D) în ventriculii stângi de la șoareci cu conținut scăzut de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi. E și F: Analiza Western blot a proteinelor hipertrofice calcineurina A (E) și ubiquitin (F) în ventriculii stângi de la șoareci cu conținut scăzut de grăsimi și cu conținut ridicat de grăsimi. Datele sunt mijloace ± SE; n = 4-8. *P

Efectul adenovirusului DN foxo3a asupra răspunsului indus de acidul palmitic asupra Akt, PTEN și GATA4.

Pentru a examina relația cauzală dintre modificarea indusă de o dietă bogată în grăsimi în Akt-Foxo3a și hipertrofia cardiacă, s-a efectuat un studiu de transfecție adenovirală ex vivo pentru a transfecta virusul DN Foxo3a în mioblastele H9C2 timp de 6 ore înainte ca celulele să fie expuse la acidul palmitic (0,8 mM) timp de 24 de ore. Analiza noastră imunoblotantă a arătat că acidul palmitic a reglat semnificativ markerii hipertrofici, inclusiv PTEN și GATA4, fără o modificare evidentă în Akt și pAkt. Interesant este că adenovirusul DN Foxo3a a imitat reglarea ascendentă a GATA4 indusă de acidul palmitic fără a provoca niciun efect aditiv cu acidul palmitic. DN Foxo3a a indus în sine reglarea în sus a pAkt și reprimarea PTEN, al cărui efect a fost abrogat de acidul palmitic (Fig. 6). Aceste date au sugerat că DN Foxo3a poate declanșa fosforilarea Akt și expresia markerului hipertrofic cardiac, care amintește de dieta bogată în grăsimi și respectiv de acid palmitic.

FIG. 6.Analiza Western blot a Akt, fosfatază și tensin omolog total și fosforilat (PTEN) și GATA4 în celulele de mioblast H9C2 tratate cu acid palmitic 0,8 mM timp de 24 de ore. O cohortă de celule fusese transfectată cu virusul Foxo3a dominant-negativ (DN) (1: 1.000) timp de 6 ore înainte de expunerea la acid palmitic. A: geluri reprezentative folosind anticorpi specifici. B: total Акт. C: Akt fosforilat (pAkt). D: raport pAkt-toAkt. E: PTEN. F: GATA4. Datele sunt mijloace ± SE; n = 6-8 pe grup. *P

O descoperire destul de interesantă din studiul nostru a descris că virusul DN Foxo3a a imitat fosforilarea bazală Akt și proteina hipertrofică GATA4 în obezitatea asociată cu o dietă bogată în grăsimi. Reglarea ascendentă a GATA4 în obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi este sincronizată cu reglarea descendentă a transcripției genelor specifice atrofiei pentru a promova hipertrofia cardiacă și cardiomiopatia hipertrofică probabilă. Această noțiune este întărită de constatările noastre că acidul palmitic a promovat direct expresia GATA4 în mioblastele H9C2. Nivelurile de acid palmitic, principalul acid gras saturat liber eliberat din țesutul adipos, sunt crescute în obezitate și contribuie la complicații cardiovasculare asociate obezității (51). Mecanismul celular responsabil de transcrierea genei de atrofie reprimată în obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi nu este pe deplin înțeles, deși interacțiunea dintre coactivatorul transcripțional PGC-1α (receptorul activat al proliferatorului peroxizom-coactivator γ) și factorul transcripțional Foxo pot juca un rol ( 36). Studii suplimentare sunt justificate pentru a examina reglarea transcripției genelor atrofiei după consumul de diete bogate în grăsimi, cu sau fără dezvoltarea obezității.

Datele noastre ex vivo au sugerat, de asemenea, un posibil mecanism de feed-forward între Akt și molecula sa de semnalizare în aval Foxo3a, deoarece transfecția mutantului Foxo3a a stimulat fosforilarea Akt. Acest scenariu feed-forward este susținut de noțiunea că gena de atrofie atrogin-1 inhibă hipertrofia cardiacă dependentă de Akt prin coactivarea dependentă de ubiquitină a proteinelor forkhead (22). Cu toate acestea, prezentul nostru studiu nu a reușit să detecteze nicio modificare a expresiei ubiquitinei ca răspuns la obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi, nefiind favorabil rolul degradării proteinelor asociate ubiquitinei în hipertrofia cardiacă și disfuncția cardiacă asociată cu obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi. Proteazomul ubiquitin este o protează în formă de butoi capabilă să recunoască și să distrugă proteinele decorate cu cel puțin patru reziduuri de ubiquitină (31). De asemenea, datele noastre au indicat, de asemenea, un rol puțin probabil al calcineurinei în hipertrofia cardiacă și disfuncția contractilă în obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi.

Atrogin-1 este o proteină F-box care inhibă hipertrofia cardiacă prin participarea la o cale dependentă de Akt- și ubiquitin ligază. Ca urmare, promotorul hipertrofic al calcineurinei poate fi degradat. S-a sugerat că atrogin-1 nu afectează activitatea Akt în sine, ci servește mai degrabă ca un coactivator pentru membrii factorilor de transcripție a furcii în aval de Akt (22). Șoarecii cu supraexprimare cardiacă a atroginei-1 au prezentat factori transcripționali ai forțelor reglate în sus concomitent cu suprimarea hipertrofiei cardiace, în timp ce șoarecii lipsiți de atrogin-1 au demonstrat fenotipul fiziologic opus, sugerând că atrogina-1 poate perturba hipertrofia cardiacă prin efectele sale asupra factorilor de transcripție a forței (22). ). Această noțiune este susținută de datele noastre experimentale privind expresia mRNA atrogin-1 suprimată și fosforilarea bazală crescută a Foxo3a (mai puțină expresie a factorului transcripțional activ), deși acest proces poate fi independent de sistemul ubiquitin-proteazom și calcineurină.

Limitări experimentale

În concluzie, studiul nostru a oferit dovezi că anomaliile geometrice, contractile miocardice și intracelulare ale Ca 2+ în obezitatea indusă de dietă cu conținut ridicat de grăsimi pot fi asociate cu factorul de transcripție suprimat (fosforilarea bazală ridicată a Foxo3a) și transcripția genetică specifică atrofiei. Având în vedere efectul provocat de adenovirusul DN Foxo3a asupra fosforilării Akt și reglării în sus a proteinelor hipertrofice care amintesc de dieta bogată în grăsimi sau acidul palmitic, datele noastre susțin ipoteza nouă că obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi (posibil rezistența la insulină și diabetul de tip 2) ) suprimă factorul de transcripție a furcii prin activarea cronică a Akt. Activarea cronică Akt este capabilă să anuleze programul antigrowth indus de Foxo. De asemenea, alți agoniști hipertrofici, cum ar fi angiotensina II, pot declanșa inactivarea proteinelor Foxo în cardiomiocite printr-un mecanism dependent de fosfatidilinozitol 3-kinază/Akt. Este imperativ să examinăm rolul factorilor de transcripție Akt-forkhead în obezitate și hipertrofie cardiacă indusă de diabet și cardiomiopatie hipertrofică, astfel încât să se poată realiza strategii terapeutice optime care vizează această cascadă de semnalizare.

Această lucrare a fost susținută parțial de Asociația Americană a Inimii Pacific Mountain Affiliate (# 0355521Z) și National Institutes of Health University of Wyoming Northern Rockies Regional Institutional Development Award Network of Biomedical Research Excellence (# 5P20RR016474).

NOTĂ DE PICIOASĂ

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, articolul trebuie marcat prin prezenta „publicitate”În conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Mulțumim Dr. Ji Li pentru sprijin generos, precum și dr. Qun Li și Nair Sreejayan pentru asistență în studiul de transfecție Foxo3a.