Abstract

  • catepsina B
  • macrofage
  • șoarece
  • cancer mamar
  • metastaze

Introducere

Mai mult, expresia crescută și activitatea proteolitică a proteazelor lizozomale (de exemplu, aspartil proteazele catepsină D și cisteina proteaze CTSB și catepsina L) au fost adesea corelate pozitiv cu prognostic slab pentru pacienții cu o varietate de afecțiuni maligne, inclusiv adenocarcinoame mamare (14 - 17). Majoritatea dovezilor experimentale pentru implicarea cisteinei proteazelor lizozomale în tumorigeneză au fost obținute folosind modele de cultură ex vivo (18-20). Recent, un studiu care utilizează un inhibitor cu spectru larg pentru cisteinele catepsine în modelul de șoarece Rip1-Tag2 a identificat rolurile pentru cisteinele catepsine în angiogeneză și creșterea și invazivitatea tumorii în tumorile pancreatice din insulă (21). Deși aceste studii confirmă în mod clar importanța acestei clase de proteaze, ele nu au oferit roluri specifice pentru CTSB în progresia și metastaza cancerului in vivo.

Pentru a aborda rolul CTSB în creșterea și metastaza cancerului, am stabilit un model de cancer mamar de șoarece în absența CTSB prin încrucișarea șoarecilor deficienți de CTSB (22) cu o tulpină de șoareci susceptibilă de cancer mamar [antigen T poliamatic mediu (PyMT) șoareci], în care expresia PyMT este direcționată către epiteliul mamar de virusul tumorii mamare de șoarece (MMTV) - repetare lungă terminală (23). Aici, arătăm un efect major al CTSB asupra progresiei carcinoamelor mamare induse de PyMT și formarea metastazelor pulmonare. În plus, descoperirile indică o contribuție substanțială a CTSB de la celulele canceroase, precum și de la celulele micro-mediului tumorii la dezvoltarea metastazelor pulmonare experimentale.

Materiale și metode

Animale. Pentru a reduce influența genetică de fundal ca variabilă în experiment, șoarecii cu deficiență de CTSB (22) au fost încrucișați timp de șapte generații la tulpina transgenică de șoarece FVB/N-TgN (MMTVPyVT) 634Mul (PyMT; ref. 23), care a fost obținut de la laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME). După intercross, șoarecii tumorali de tip sălbatic, heterozigot și deficienți pentru CTSB au fost denumiți PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/− și PyMT; ctsb -/-, respectiv.

Studiu de progresie tumorală. Începând cu vârsta de 30 de zile, șoarecii femele au fost examinați de trei ori pe săptămână pentru dezvoltarea tumorilor mamare prin palparea degetelor într-un mod orbit de genotip. După ce tumorile au fost detectate pentru prima dată, diametrele tumorilor au fost măsurate cu etriere în fiecare a doua zi până la vârsta de 98 de zile. Pentru studiul progresiei tumorii masculine, șoarecii au fost palpați de două ori pe săptămână.

Histomorfometrie. Pentru măsurarea volumetrică a metastazelor pulmonare totale sau a coloniilor tumorale diseminate în plămâni, plămânii crioembedded au fost tăiați transversal la trahee în dale sistematice aleatorii de 2 mm grosime. Cele 5 până la 7 plăci obținute din fiecare plămân au fost încorporate cu Tissue-Tek într-un singur bloc așa cum sa specificat anterior (24). Din fiecare bloc, au fost obținute secțiuni de criostat de 5 μm și colorate cu H&E. Determinarea stereologică a volumelor de metastaze s-a făcut prin numărarea punctelor asistată de computer, așa cum s-a descris anterior (24).

Imunohistochimie și imunofluorescență. Anticorpul CTSB anti-șobolan de capră (furnizat de E. Weber, Universitatea Martin-Luther, Halle, Germania; ref. 22) a fost utilizat pentru detectarea CTSB. Pentru microscopia cu imunofluorescență dublă CTSB-F4/80, anticorpul CTSB anti-șobolan de capră a fost vizualizat de anticorpul anti-capră Alexa Fluor 488 de măgar (Invitrogen Molecular Probes, Karlsruhe, Germania). După blocarea cu IgG de capră, antigenul macrofagului F4/80 a fost detectat de anticorpul F4/80 anti-șoarece de șobolan (Serotec, Dusseldorf, Germania) urmat de Alexa Fluor 546 - anticorp anti-șobolan marcat cu capră (Invitrogen Molecular Probes) . Colorarea nucleară a fost făcută cu Hoechst 33342.

Izolarea celulelor tumorale primare de carcinoamele mamare induse de PyMT. Celulele tumorale primare PyMT au fost obținute prin disocierea mecanică și enzimatică a carcinoamelor solide induse de PyMT. Suspensia obținută a fost transferată secvențial prin strecurătoare de celule de 100 și 40 μm, spălată de două ori cu PBS și cultivată timp de 12 ore. Imunodetectarea cu un anticorp pan-citokeratină (Sigma, Hamburg, Germania) a relevat 98% din celulele tumorale citokeratin-pozitive după 12 ore în cultură. Celulele vitale și aderente au fost recoltate prin tripsinizare, PBS spălate și congelate imediat în mediu conținând 10% DMSO pentru utilizare ulterioară.

Testul colonizării pulmonare după i.v. injectarea de celule tumorale PyMT marcate cu LacZ. Celulele tumorale primare izolate au fost etichetate genetic prin transducție retrovirală a genei LacZ bacteriene conform instrucțiunilor producătorului (BioCarta, Ann Arbor, MI; ref. 25). Marcarea LacZ a fost verificată prin colorare X-gal și numai testele cu eficiență de transducție de 100% au fost utilizate pentru test. La două zile după transducție, 1 × 105 celule tumorale primare marcate cu LacZ din genotipurile PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/− sau PyMT; ctsb -/- (patru șoareci donatori per genotip) au fost inoculați i.v. în venele cozii ctsb +/+, ctsb +/− și ctsb -/- șoareci congenici primitori (cinci destinatari pe donator). Douăzeci și unu de zile după inocularea celulelor tumorale, plămânii au fost izolați și colorați cu X-gal, iar numărul de colonii de suprafață pe plămâni a fost cuantificat.

Test de invazie celulară in vitro. Inserțiile de cultură celulară sigilate de o membrană microporoasă de dimensiunea porilor de 8 μm umplute cu Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Germania) au fost utilizate pentru studii de invazie. Matrigelul a fost uscat într-o glugă laminară și reconstituit cu 500 μL DMEM timp de 1 oră la 37 ° C. Compartimentele interioare ale inserțiilor de cultură celulară au fost umplute cu 5 × 104 celule PyMT în DMEM fără FCS. Inhibitorul general al cisteinei catepsină E64 a fost adăugat imediat după placare celulară (concentrație finală, 10 μmol/L) și anticorpul de catepsină X neutralizant (R&D Systems, Minneapolis, MN) la o concentrație finală de 1 μg/ml a fost preincubat cu celule timp de 15 minute la 37 ° C înainte de test. Compartimentele inferioare au fost umplute cu 1 mL DMEM conținând 10% FCS ca chemoatractant și, după caz, 10 µmol/L E64 sau 1 µg/mL de anticorp cathepsină X neutralizant. După 20 de ore la 37 ° C și 5% CO2, inserțiile au fost îndepărtate, iar celulele atașate la exteriorul membranei poroase au fost obținute prin tripsinizare și răzuire ușoară. Celulele vitale au fost numărate cu contorul de celule CASY (Schärfe Systems, Reutlingen, Germania).

Test de imunetichetare cu catepsină X. Pentru imunodetecția catepsinei X de suprafață celulară, cisteina proteaza a fost marcată de DCG-04 așa cum s-a descris mai sus și purificată prin utilizarea de margele magnetice cuplate covalent cu streptavidină (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal, Oslo, Norvegia). Cisteina proteazei de suprafață precipitate au fost rezolvate cu 15% SDS-PAGE, transferate pe membranele PVDF și testate cu anticorpi anti-catepsină X de capră (sisteme R&D). Expresia totală de proteine ​​a catepsinei X a fost determinată prin Western blot a lizatului celular total cu anticorpi catepsina X și a fost dezvăluită utilizând o reacție de chemiluminescență îmbunătățită (Pierce, Rockford, IL). Rezultatele au fost normalizate la niveluri de β-actină.

PCR cantitativ în timp real. ARN total a fost izolat din tumorile mamare PyMT cu un kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Primele șabloane de ADNc catenă au fost transcrise invers din 5 μg ARN total (Invitrogen, Karlsruhe, Germania). Formarea produselor PCR a fost măsurată continuu prin încorporarea SYBR Green cu sistemul de detecție PCR în timp real iCycler (Laboratoarele Bio-Rad), iar cantitățile relative de mRNA CTSB, catepsină X și PyMT au fost normalizate la gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) transcriere. Primerii specifici genei au fost după cum urmează: CTSB, 5'-TGCGTTCGGTGAGGACATAG-3 '(înainte) și 5'-CGGGCAGTTGGACCATTG-3' (invers); catepsina X, 5'-TATGCCAGCGTCACCAGGAAC-3 '(înainte) și 5'-CCTCTTGATGTTGATTCGGTCTGC-3' (invers); GAPDH, 5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3 '(înainte) și 5'-GATGCAGGGATGATGTTC-3' (invers); și PyMT, 5′-CTCCAACAGATACACCCGCACATACT-3 ′ (înainte) și 5′-GCTGGTCTTGGTCGCTTTCTGGATAC-3 ′ (invers). Pentru cuantificarea transgenului PyMT în coloniile tumorale pulmonare, ADN-ul genomic a fost izolat din plămânii șoarecilor primitori de celule PyMT. PCR în timp real pentru cuantificarea PyMT și GAPDH a fost așa cum s-a descris mai sus.

Detectarea activității enzimei CTSB. Activitatea proteolitică CTSB a fost determinată în fracțiuni lizozomale (10 μg proteină) în prezența substratului fluorogenic Z-Phe-Arg-4-metil-cumarină-7-amidă (20 μmol/L; Bachem, Bubendorf, Elveția) și în prezența sau absența inhibitorului specific CTSB CA074 (20 nmol/L; Bachem). Eliberarea 7-amino-4-metil-cumarinei a fost monitorizată prin spectrofluorometrie la lungimi de undă de excitație și emisie de 360 ​​și respectiv 460 nm.

Analize statistice. Comparațiile mijloacelor aritmetice între mai multe grupuri au fost analizate prin testul t (față-verso) sau ANOVA pentru experimente cu mai mult de două subgrupuri. Testele post-hoc și comparațiile multiple pe perechi au fost făcute cu testul t (față-verso). Proporțiile au fost comparate prin testul χ 2, iar analiza statistică a graficelor Kaplan-Meier a fost făcută prin testul log-rank. P ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ statistic. Analizele statistice ale metastazelor pulmonare s-au făcut prin analiza covarianței (ANCOVA; Date suplimentare).

Rezultate

Suprimarea creșterii tumorale induse de PyMT la șoareci femele cu deficit de CTSB. A, grafice Kaplan-Meier pentru PyMT fără tumori; ctsb +/+ (n = 18), PyMT; ctsb +/− (n = 20) și PyMT; ctsb -/- (n = 22) șoareci femele. Primele tumori mamare palpabile au fost detectate semnificativ mai târziu la PyMT; șoareci femele ctsb -/- decât la PyMT; șoareci femele ctsb +/+ (P +/− nu au prezentat nicio diferență semnificativă față de celelalte grupuri. B, cinetica detaliată a creșterii tumorale în PyMT; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/−, și PyMT; ctsb -/- șoareci femele. Curbele, numărul mediu de tumori determinat în intervale de 2 zile în funcție de diametrul lor de 1 cm. Asteriscuri, diferențe semnificative statistic în numărul de tumori între knockout CTSB și grupuri de tip sălbatic de șoareci transgenici PyMT, deși șoarecii PyMT; ctsb +/− femele nu au prezentat nicio diferență semnificativă față de celelalte grupuri. *, P +/+, PyMT; ctsb +/− și PyMT; grupuri ctsb -/- respectiv Frecvențele tumorilor în funcție de diametrul lor au fost comparate între cele trei genotipuri CTSB prin testul χ 2.

În plus, am analizat dezvoltarea tumorii mamare în PyMT; ctsb +/+ (n = 15), PyMT; ctsb +/− (n = 16) și PyMT; ctsb -/- (n = 22) șoareci masculi (suplimentar Fig. S1A). Dezvoltarea tumorii mamare la șoarecii tumorali cu deficiență de CTSB masculi a fost chiar mai semnificativ inhibată în comparație cu PyMT; șoareci masculi ctsb +/+. Deși 50% dintre PyMT; ctsb +/+ și PyMT; ctsb +/− șoareci masculi au dezvoltat tumori palpabile la vârsta de 15 și respectiv 18 săptămâni, a durat 26 de săptămâni pentru a dezvolta tumori mamare la 50% din PyMT; ctsb -/- șoareci (P +/+, ctsb -/- și ctsb -/- șoareci. Spre deosebire de alte genotipuri, PyMT; ctsb -/- șoareci nu au dezvoltat tumori mai mari de 1 cm în diametru în perioada de observație de 1 lună. rezumat, aceste rezultate arată o latență tumorală crescută și o scădere a creșterii tumorii la ștergerea CTSB la șoareci PyMT femele și masculi.

Metastaze pulmonare ale carcinoamelor PyMT și colonizarea pulmonară experimentală de către celulele canceroase PyMT. O trăsătură caracteristică a modelului de șoarece adenocarcinom MMTV-PyMT este dezvoltarea a numeroase metastaze pulmonare care pot fi observate atât macroscopic, cât și microscopic până la vârsta de 3 până la 4 luni (23). Am estimat volumul total de metastaze pulmonare prin stereologie asistată de computer pe secțiuni pulmonare histologice eșantionate sistematic de la șoareci femele PyMT din toate cele trei grupuri experimentale la vârsta de 14 săptămâni (24). ANCOVA a arătat că, pe lângă genotip (ctsb +/+, ctsb +/− și ctsb -/-), greutatea tumorii primare și backcross, generația a avut și un efect semnificativ asupra volumului de metastază. Mai mult, comparativ cu grupul PyMT; ctsb +/+, volumul metastazelor pulmonare a fost redus la 45% în grupul PyMT; ctsb +/− (P = 0,01) și la 65% în grupul PyMT; ctsb -/- (Fig. 2), deși ultima diferență de volum a nodulilor tumorali metastatici nu a atins semnificația statistică (P = 0,13).

Efectul deficitului de CTSB asupra metastazelor pulmonare ale tumorilor mamare PyMT. Determinarea histomorfometrică a volumelor de metastaze pulmonare în PyMT; ctsb +/+ (n = 36), PyMT; ctsb +/− (n = 38) și PyMT; ctsb -/- (n = 32) șoareci femele la vârsta de 14 săptămâni . Cutii, valori cuprinse între percentila 25 și 75; pătrate, media ajustată obținută de ANCOVA (vezi Materiale și metode). Bare, valori minime și maxime.

Colonizarea pulmonară prin i.v. au injectat celule PyMT de genotip CTSB variabil la destinatari congenici de tip sălbatic. Numărul de colonii pulmonare (A) și volumul mediu de colonii tumorale în țesutul pulmonar (B) după injectarea PyMT primar; ctsb +/+, PyMT; ctsb +/− și PyMT; ctsb -/- celule tumorale. Volumul total al coloniilor pulmonare a fost măsurat prin cuantificarea PCR în timp real a transgenei PyMT în ADN-ul pulmonar genomic normalizat la gena GAPDH. Cantitatea de genă PyMT împărțită la numărul de colonii tumorale oferă o măsură a volumului mediu de noduli tumorali derivați de celule PyMT la un șoarece individual. Coloane, medie; baruri, SE. Nivelurile de semnificație au fost calculate prin testul t.

Discuţie

În timpul progresiei către malignitate ridicată, celulele tumorale dobândesc mutații multiple care afectează proliferarea, moartea programată și stabilitatea genetică (29). Mai mult, un microambient favorabil este esențial pentru creșterea, invazia și metastaza unei tumori (1). Proteazele capabile să degradeze proteinele ECM au fost identificate recent ca regulatori critici ai microambientului tumoral. Aici, arătăm că cisteina protează lizozomală CTSB contribuie la creșterea, invazia și procesul metastatic al carcinomului mamar indus de PyMT.

Pe scurt, rezultatele prezente sugerează că CTSB derivat atât din celulele tumorale, cât și din celulele stromale din microambient joacă roluri critice în mai multe etape ale creșterii tumorale și ale metastazei. Astfel, inhibarea farmacologică a CTSB extracelular în interiorul și în jurul unei tumori de către inhibitori impermeabili ai membranei plasmatice poate fi o cale promițătoare pentru tratamentul eficient al cancerului.

Mulțumiri

Acordați sprijin: Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 364; B12) acordă 23-7532.22-33-11/1 din Ministerul Științei și Artei, Baden-Wuerttemberg și Programul-cadru al Uniunii Europene 6, Proiect LSHC-CT-2003-503297, Cancerdegradome Krüger).

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, acest articol trebuie marcat publicitar în conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Mulțumim Susanne Dollwet-Mack, Anne Schwinde și Ulrike Stabenow (Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Freiburg, Germania) și Katja Honert (Institut für Experimentelle Onkologie, München, Germania) pentru asistență tehnică excelentă.

Note de subsol

Notă: Date suplimentare pentru acest articol sunt disponibile la Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/).

O. Vasiljeva și A. Papazoglou au contribuit în mod egal la această lucrare. O. Vasiljeva este în prezent la Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Institutul Jozef Stefan, Ljubljana, Slovenia. A. Papazoglou se află în prezent la Departamentul de Neurochirurgie Stereotactică, Spitalul Universitar din Freiburg, Freiburg, Germania. J. Deussing se află în prezent la Max-Planck-Institut für Psychiatrie, Molekulare Neurogenetik, München, Germania. N. Augustin este în prezent la Departamentul de Științe Matematice, Universitatea din Bath, Bath, Regatul Unit.

catepsina

  • Primit pe 14 decembrie 2005.
  • Revizuirea a primit 16 februarie 2006.
  • Acceptat pe 13 martie 2006.