Departamentul de afiliere pentru științe veterinare, Universitatea din Melbourne, Werribee, Victoria, Australia

deblocarea

Departamentul de afiliere pentru științe veterinare, Universitatea din Melbourne, Werribee, Victoria, Australia

Departamentul de afiliere pentru științe veterinare, Universitatea din Melbourne, Werribee, Victoria, Australia

Departamentul de afiliere pentru științe veterinare, Universitatea din Melbourne, Werribee, Victoria, Australia

Departamentul de afiliere pentru științe veterinare, Universitatea din Melbourne, Werribee, Victoria, Australia

Departamentul de parazitologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, Khon Kaen, Thailanda

Departamentul de parazitologie și Institutul de științe ale sănătății, Facultatea de Medicină, Universitatea Națională Gyeongsang, Jinju, Republica Coreea

Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Khon Kaen, Khon Kaen, Thailanda

Afiliere Queensland Tropical Health Alliance, Universitatea James Cook, Smithfield, Cairns, Queensland, Australia

Departamentul de Afiliere pentru Microbiologie, Imunologie și Medicină Tropicală, Centrul Medical al Universității George Washington, Washington, D. C., Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru științe veterinare, Universitatea din Melbourne, Werribee, Victoria, Australia

  • Neil D. Young,
  • Bronwyn E. Campbell,
  • Ross S. Hall,
  • Aaron R. Jex,
  • Cinzia Cantacessi,
  • Thewarach Laha,
  • Woon-Mok Sohn,
  • Banchob Sripa,
  • Alex Loukas,
  • Paul J. Brindley

Cifre

Abstract

Rezumatul autorului

Viermii paraziți, Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini, au un impact serios asupra sănătății a zeci de milioane de oameni din toată Asia. Cu toate acestea, cel mai mare impact este prin cancerul malign, netratabil (colangiocarcinomul) pe care îl induc acești paraziți la persoanele infectate cronic. Aceste afecțiuni hepatice sunt clasificate oficial de Organizația Mondială a Sănătății (OMS) drept agenți cancerigeni din grupa 1. În ciuda impactului lor masiv asupra sănătății umane, se știe puțin despre acești paraziți și despre relația lor cu gazda la nivel molecular. Aici, oferim prima perspectivă detaliată asupra transcriptomilor acestor flukes, oferind o bază solidă pentru toate lucrările moleculare/-omice necesare pentru a înțelege biologia lor, dar, mai important, pentru a elucida aspectele cheie ale inducerii colangiocarcinomului. Deși accentul nostru a fost pus pe paraziți, implicațiile se vor extinde mult dincolo de studiul bolii parazitare. Foarte important, perspectivele privind patogeneza infecției vor avea probabil implicații majore pentru studiul și înțelegerea altor tipuri de cancer.

Citare: Young ND, Campbell BE, Hall RS, Jex AR, Cantacessi C, Laha T și colab. (2010) Deblocarea transcriptomilor a doi paraziți cancerigeni, Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini. PLoS Negl Trop Dis 4 (6): e719. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000719

Editor: Malcolm K. Jones, Universitatea din Queensland, Australia

Primit: 18 februarie 2010; Admis: 28 aprilie 2010; Publicat: 22 iunie 2010

Finanțarea: Finanțarea din partea Consiliului de cercetare australian este recunoscută cu recunoștință (RBG). NDY a fost beneficiarul recunoscător al unui premiu Endeavour din partea guvernului australian. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Fluxurile de ficat (Platyhelminthes: Digenea) includ agenți patogeni eucarioti importanți alimentari ai oamenilor [1] - [5]. De exemplu, ficatul prezintă Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini, care provoacă bolile clonorhiasis și, respectiv, opisthorchiasis, reprezintă o problemă substanțială de sănătate publică în multe părți din Asia [2], [3], [6]. Clonorchis sinensis este endemic predominant în regiunile Chinei (inclusiv Hong Kong și Taiwan), Coreea și Vietnamul de Nord [2], [6], în timp ce O. viverrini este endemic în toată Thailanda, Republica Democrată Populară Lao, Vietnam și Cambodgia [7] . Ambii paraziți provoacă suferințe imense la zeci de milioane de oameni și se estimează că peste 600 de milioane de oameni sunt expuși riscului de infecție [2], [8]. În ciuda eforturilor de a controla aceste două afecțiuni hepatice, prevalența infecției poate fi de până la 70% în unele regiuni, inclusiv provincia Guangxi din China (C. sinensis) și provincia Khon Kaen din Thailanda (O. viverrini) [2], [7]. O lovitură asemănătoare, O. felineus, este endemică în Siberia și regiunile estice ale fostei URSS și provoacă o boală și o sarcină similară cu O. viverrini și C. sinensis [4].

La om, debutul colangiocarcinomului apare cu clonorhiază cronică sau opistorhiază, asociată cu leziuni hepatobiliare, inflamații, fibroză periductală și/sau răspunsuri celulare la antigeni din infecția cu infecție [24]. Aceste condiții predispun la colangiocarcinom, posibil printr-o susceptibilitate sporită a ADN-ului la deteriorarea cancerigenilor [19], [20], [25] - [27]. Se raportează că leziunile hepatobiliare cronice sunt multifactoriale și se consideră că provin dintr-o iritare mecanică continuă a epiteliului de către flukurile prezente, în special prin fraierele lor, metaboliții și antigenii excretați/secretați [28], [29], precum și procesele imunopatologice . [21]. În regiunile în care O. viverrini este extrem de endemic, incidența colangiocarcinomului este fără precedent [3], [30]. De exemplu, colangiocarcinoamele reprezintă 15% din cancerul hepatic primar la nivel mondial, dar în regiunea thailandeză Khon Kaen, această cifră crește la 90%, cea mai mare incidență înregistrată a acestui cancer din lume [31].

Până în prezent, cele mai multe cercetări biologice moleculare ale trematodelor importante din punct de vedere socioeconomic s-au concentrat asupra loviturilor de sânge uman, Schistosoma mansoni și S. japonicum, culminând recent cu determinarea secvențelor lor de genom nuclear [35], [36]. Aceste seturi de date genomice oferă o resursă de neprețuit pentru a sprijini explorarea biologiei fundamentale și evoluția flukelor, precum și interacțiunile lor gazdă-parazit [36]. Cu toate acestea, biologia schistozomilor, care trăiesc ca adulți dioici în fluxul sanguin al gazdelor de mamifere, este foarte distinctă de cea a afecțiunilor hepatice hermafrodite, precum C. sinensis și O. viverrini. În prezent, un total de doar,0008.000 de etichete de secvență exprimate (EST) sunt disponibile public pentru C. sinensis [37] - [39] și O. viverrini [40], un set de date mult prea mic pentru a oferi suficiente informații despre transcriptomi în acest scop. de sprijinire a cercetării genomice și a altor cercetări moleculare fundamentale.

Unele studii recente genomice, bioinformatice și proteomice [29], [41] - [45] indică perspective unice și incitante de a explora căile biochimice, fiziologice și biologice cheie în afecțiunile hepatice și de a prevedea și prioritiza țintele medicamentoase noi. În special, caracterizarea transcriptomului flasculului hepatic comun, Fasciola hepatica, utilizând platforma bioinformatică de secvențiere de generație următoare, a descoperit numeroase molecule de relevanță biologică, dintre care unele sunt deduse a fi implicate în procesele biologice cheie sau căile care ar putea servi ținte cheie pentru noile medicamente sau vaccinuri trematocide [46]. Folosind o platformă similară, am caracterizat aici transcriptomii etapelor adulte ale C. sinensis și O. viverrini, pentru a furniza resurse esențiale pentru explorările viitoare genomice, proteomice, metabolomice și biologice ale acestor agenți patogeni importanți și pentru a sprijini eforturile viitoare. spre o mai bună intervenție și control al colangiocarcinomului.

Materiale și metode

Producția de Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini

Secvențierea și asamblarea seturilor de date de secvență

O conductă automată, în silico-asamblare (Eurofins MWG Operon) a fost utilizată pentru a asambla noile date de secvență pentru fiecare C. sinensis și O. viverrini. Lecturi de înaltă calitate, apelate de bază și decupate din fiecare set de date au fost extrase din fișierele SFF și contigurile acestora au fost asamblate folosind MIRA v.2.9 (http://chevreux.org/projects_mira.html) [53]. Lungimile medii ± abaterile standard în baze au fost calculate pentru anumite subseturi de date ale secvenței de nucleotide. Un al doilea ansamblu al fiecărui set de date a fost realizat folosind regiuni de secvență prezise pentru a codifica cadre de citire deschise (ORF) pentru a grupa în mod specific secvențe cu regiuni similare de codificare a proteinelor [46]. ORF-urile au fost prezise din contigurile asamblate de MIRA și singletonii neasamblate folosind ESTScan folosind setări implicite [54]. Pentru fiecare set de date, secvențele cu ORF-uri au fost re-asamblate în supercontiguri utilizând Programul de asamblare Contig v.3 (CAP3) [55]. Pentru a elimina redundanța, secvențele de nucleotide au fost re-grupate folosind programul BLASTclust (BLAST v.2.2.20; ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/), permițând secvențelor să se grupeze dacă sunt aliniate între ele > 60% din lungimea lor și identitate comună> 95% reziduuri de aminoacizi.

Adnotare

Secvențele de aminoacizi au fost supuse analizei utilizând TMHMM (un program de predicție a topologiei membranei) [58] pentru a prezice domeniile transmembranare. Proteinele putoase excretoare/secretoare (ES) au fost prezise din secvențe de aminoacizi deduse reprezentând C. sinensis și O. viverrini folosind o conductă bioinformatică descrisă anterior [44]. Pe scurt, proteinele ES au fost selectate pe baza prezenței unei peptide semnal la capătul N-terminal utilizând SignalP 3.0 [59] și absența domeniilor transmembranare. Pentru a oferi un sprijin suplimentar pentru clasificarea lor, proteinele ES prevăzute cu o lungime de> 50 de reziduuri de aminoacizi au fost comparate cu proteinele secretate cunoscute [60] și peptidele semnal [61] (http://www.signalpeptide.de/) și subsetul de proteine ​​cu omologi cunoscuți (BLASTn, valoare E -05) au fost reținute și sintetizate pe baza căii biochimice deduse folosind KOBAS.

Rezultate

Asamblarea transcriptomilor etapelor adulte ale Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini

Au fost generate peste 500.000 de secvențe pentru fiecare C. sinensis (n = 574.448; 351 ± 141 baze; adică media ± deviație standard) și O. viverrini (642.918; 373 ± 133 baze) (Tabelul 1). Datele secvenței au fost depuse sub numărul de acces SRA012272 în arhiva citită în secvență a NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra). Căutările BLASTn (valoarea E -05) au arătat că cele mai multe (92-97%) secvențe disponibile în bazele de date publice pentru aceste flukes au fost conținute în seturile lor de date respective. Deoarece cele mai multe (88-91%) secvențe generate pentru fiecare specie au fost noi, doar datele actuale au fost asamblate (vezi Tabelul 1). Ansamblul a permis ca aproximativ 84% din secvențe să fie grupate în> 42.000 de contiguri. Pentru C. sinensis, 42.179 contigs aveau 711 ± 483 baze în lungime, cu o adâncime medie de acoperire de 10,8 ± 20,0 citiri per contig. Pentru O. viverrini, 60.833 contigs aveau o lungime de 680 ± 438 baze, cu o adâncime medie de acoperire de 8,6 ± 14,5 lecturi per contig. Numărul total de secvențe 92.123 (279 ± 161 baze; C. sinensis) și 101.654 (307 ± 162 baze; O. viverrini) au fost singletoni și, prin urmare, nu au putut fi asamblate.

În total, 134.301 secvențe C. sinensis (415 ± 363 baze) și 162.487 secvențe O. viverrini (447 ± 348 baze) au fost reținute pentru analize ulterioare. Din datele asamblate de MIRA, ORF-urile au fost prezise pentru 88.714 (66,1%) de secvențe C. sinensis (383 ± 371 baze) și 107.217 (66,0%) de secvențe O. viverrini (389 ± 355 baze). CAP3 a grupat aproximativ jumătate din aceste ORF în supercontiguri îmbogățite cu ORF, echivalând cu 12.050 secvențe (980 ± 747 baze) pentru C. sinensis și 14.698 secvențe (939 ± 731 baze) pentru O. viverrini, cu o adâncime medie de acoperire de 3,6– 3,7 citiri per supercontig pentru fiecare specie. Pentru fiecare specie, conținutul mediu de G + C (~ 47 ± 4%) a fost similar cu estimările pentru F. hepatica, un trematod digenean legat de C. sinensis și O. viverrini [46], [62]. Din ambele seturi de date, un număr mic (49-82) de secvențe redundante au fost excluse în urma re-grupării secvențelor folosind BLASTclust. În plus, au fost excluse secvențele cu similitudine la nivelurile de nucleotide (valoare E -05) și proteine ​​(valoare E -50) la molecule potențiale gazdă (M. auratus) sau organisme microbiene. ORF-urile atât secvențelor grupate, cât și secvențelor unice (singletoni) au fost supuse unei analize suplimentare.

Adnotarea proteinelor codificate în transcriptomul Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini

Proteine ​​prevăzute cu similaritate semnificativă a secvenței (căutare permisivă BLASTx cu valoare E -05) printre trematode parazitare, Clonorchis sinensis și Opisthorchis viverrini (familia Opisthorchiidae), Schistosoma mansoni (Schistosomatidae) și Fasciola hepatica (Fasciolidae).

Când secvențele de C. sinensis și O. viverrini cu omologie cu cele din seturile de date genetice non-redundante (disponibile din bazele de date genetice S. mansoni, S. japonicum și ENSEMBL) au fost grupate (BLASTx, valoare E -05), numărul de secvențe omoloage prezise pentru a codifica proteinele a fost de 1,4 până la 2,4 ori mai mare decât se aștepta (a se vedea tabelul 5). Gruparea secvențelor îmbogățite cu ORF la gene unice a dus la o predicție de 22.824-31.054 gene pentru C. sinensis și 25.871-42.692 pentru O. viverrini.

Similitudinea semnificativă între secvențele de proteine ​​prezise pentru fiecare C. sinensis și O. viverrini și cele din baza de date KOBAS au permis alocarea a 9.847 și 11.092 secvențe la termenii de cale biologică standardizată (KEGG) 242 și 249, respectiv (Tabelul 2). La fel ca adnotarea funcțională dedusă folosind termenii GO, căile biologice au fost reprezentate în mod similar pentru cele două seturi de date transcriptomice (Tabelul 7). O proporție semnificativă de molecule a fost asociată cu metabolismul carbohidraților (7-9%) sau aminoacizilor (8%), în acord cu rezultatele analizei bazate pe GO (Tabelul 6). De asemenea, au fost identificate frecvent căi de procesare celulară, inclusiv cele asociate cu transducția semnalului (11-12%), comunicarea celulară (6-7%) și sistemele endocrine (7-8%) și imune (4-5%)). Foarte important, 7-8% dintre proteinele prezise din cele două afecțiuni hepatice asiatice au fost legate de căi biologice care, atunci când sunt perturbate, pot duce la dezvoltarea cancerului la om (vezi Tabelul 7), inclusiv molecule similare integrinelor, GTPaze reglatoare, tirozină. și serină/treonină kinaze și factori de creștere [63], [64].

Familiile de proteine ​​(A) și căile biologice (B) au fost atribuite proteinelor pe baza omologiei lor la proteinele adnotate din căile biologice ale Enciclopediei de gene și genomi (KEGG) de la Kyoto. În cadrul categoriilor de ontologie genică (GO), procesele biologice parentale (adică nivelul 2) biologice (C) au fost atribuite proteinelor în conformitate cu domeniile InterPro cu omologie la gene adnotate funcțional. Categoriile individuale KEGG și GO pot avea mai multe mapări.

Discuţie

Transcriptomii definiți aici reprezintă stadiul adult al fiecărui C. sinensis și O. viverrini. Cu toate acestea, există surprinzător de puține date transcripționale pentru alte etape de dezvoltare, cu doar 419 EST disponibile pentru stadiul metacercarial al C. sinensis [38] și niciunul pentru O. viverrini. În prezent, nu există date de secvență pentru celelalte etape de dezvoltare (inclusiv miracidium, sporocist, redia, cercaria și furtuna imatură) ale acestor paraziți. Studiile viitoare ar trebui să se concentreze acum pe expresia diferențială a genelor prin etapele multiple de viață liberă și parazite ale istoriei vieții. Datele transcripționale pentru C. sinensis și O. viverrini pentru adulți vor sta la baza caracterizării profilurilor transcripționale ale acestei etape, utilizând secvențierea de nouă generație, microarray și/sau analize PCR cantitative în timp real, care vor avea implicații importante pentru înțelegerea dezvoltării, reproducerii. precum și interacțiunile parazit-gazdă la nivel molecular. Foarte important, elucidarea transcriptomilor atât a copiilor imaturi, cât și a celor adulți oferă perspectiva explorării modificărilor imunopatologice, precum și a carcinogenezei la om, în diferite stadii ale clonorhiazei și opistorhiazei [6], [81].

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: NDY. A efectuat experimentele: NDY. Analiza datelor: NDY BEC RSH ARJ CC. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: TL WMS BS. Am scris lucrarea: NDY. Contribuție la redactarea manuscrisului: ARJ TL PJB AL. Supervizat proiectul: RBG.