Editat de Robert J. Cousins, Universitatea din Florida, Gainesville, FL și aprobat la 7 iunie 2010 (primit pentru revizuire la 11 decembrie 2009)

colinei

Abstract

Studii de imunohistochimie în creierul fetal. A și B: imagini fluorescente 200X reprezentative ale regiunii 1 CORNUS AMMONI (CA1) a hipocampului E17. O imunomarcare multiplex a fost efectuată pentru BrdU (colorare aurie - ALEXA 555, vârf de săgeată alb A), izolectină IB4 (fluorescență verde - ALEXA 488, vârf de săgeată roșie A) și DAPI (fluorescență albastră legată de ADN genomic, vârf de săgeată alb B). Indicele de proliferare a EC a fost calculat ca raport între numărul de nuclei BrdU pozitivi colocalizați cu izolectină (A) și nucleii DAPI pozitivi colocalizați cu izolectină (B). Insectele mici sunt imagini ale întregii zone de hipocamp capturate cu mărire 50X (A - izolectină-BrdU și B - DAPI-izolectină). C și D: colorarea factorului VIII RA a hipocampului fetal E17 de șoarece. Imagini fluorescente 200X reprezentative ale vaselor de sânge care exprimă factorul VIII RA într-o secțiune de hipocampal de 5 μm; achiziția imaginii a fost efectuată cu un filtru de rodamină - celulele sanguine fluorescente roșii (colorant ALEXA 546 nm; vârfuri de săgeți albe) și nuclei fluorescenți albastru (colorare DAPI). C prezintă vase de sânge mici cu traiectorii și niveluri diferite ale factorului VIII, precum și nuclee DAPI pozitive ale CE. D prezintă un vas de sânge mai intens, cu factor VIII pozitiv, cu un calibru mai mare situat în imediata apropiere a girusului dentat.

Deficitul de colină maternă scade proliferarea celulelor endoteliale în hipocampul fetal E17: Șoarecii însărcinați au fost hrăniți cu dietă CD, CT sau CS între zilele 12-17 ale gestației și creierele fetale au fost colectate la E17. La E15, toate barajele au primit o doză intraperitoneală (i.p.) de BrdU. Secțiunile cerebrale au fost sondate cu izolectină IB4 și anticorpi anti-BrdU. Indicele de proliferare al EC a fost calculat ca raportul dintre celulele pozitive BrdU-izolectină pozitivă și celulele pozitive DAPI-izolectină din ambele hipocampus (sau ambele gyri dentate) din fiecare creier în șase secțiuni consecutive de 5 μm. Suprafața hipocampului întreg (H) și a girusului dentat (DG) au fost măsurate pentru fiecare probă și s-a constatat că este constantă între tratamente (inserție mică). Datele sunt prezentate ca medie ± SE. n = 6 pui din 6 baraje/grup. Grupurile au fost comparate utilizând un mod ANOVA urmat de testul Tukey-Kramer. ** = p 25% în CD comparativ cu CT sau CS (p Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Deficitul de colină alimentară maternă scade numărul vaselor de sânge din hipocampul fetal

Deși am observat modificări în regiunea hipocampului, nu s-au observat diferențe în neocortexul cingulat și cel posterior (Tabelul S1). Sugerăm că colina acționează prin modificarea semnelor epigenetice și că acest lucru poate să apară în celulele progenitoare numai la o anumită perioadă în care acestea se divid și se diferențiază. Neurogeneza și angiogeneza în zonele corticale încep înainte de ziua embrionară 12, începutul manipulării noastre dietetice. Specificitatea regională reflectă probabil aceste diferențe.

Deficitul de colină maternă a crescut numărul de celule endoteliale care exprimă complexul factorului VIII Von Willebrand în hipocampul fetal.

Deficitul de colină modifică starea de metilare a insulelor CpG în Vegfc și Angpt2. NPC-urile E14 au fost crescute cu un control scăzut al mediului CS așa cum este descris în Fig. legenda 1 (n = 4/grup). Probele de ADN tuns enzimatic au fost îmbogățite în cistozină metilată urmând protocolul MIRA și analizate prin PCR în timp real, așa cum este descris în secțiunea Materiale și metode. A și C: Diagrama (la scară) a Vegfc (80 Kb) și, respectiv, Angpt2 (16 Kb), conținând primele trei insule CpG analizate și caracteristicile genei în imediata apropiere a acestor CpG: exonii 1 și 2, TSS. B: Metilare (se pliază la intrarea ADN) a insulelor CpG din Vegfc. Inserția arată curbele de amplificare ale genei Xist de control pozitiv și nicio amplificare pentru gena APC de control negativ detectată prin PCR în timp real; D: Metilare (se pliază la intrarea ADN) a insulelor CpG în Angpt2. Valorile sunt raportate ca media ± SE. Analiza statistică a fost realizată cu REST (test de randomizare a realocării cu perechi de repaus). ** = p ΔΔCT) a fost utilizat pentru a analiza modificările expresiei genelor așa cum este descris în altă parte (74).

Test metilat de recuperare a insulei CpG (MIRA).

ADN-ul genomic a fost izolat din probe NPC folosind Qiagen DNAeasy minicolumns (Qiagen) după protocolul producătorului (75), cuantificat cu un spectrofotometru Nanodrop 8000 (Nanodrop) și depozitat în tampon de eluare la -80 ° C. În pregătirea pentru etapa de îmbogățire, 4.000 ng de ADNc din fiecare probă au fost digerate cu enzimă de restricție MseI timp de 2 ore la 37 ° C urmată de inactivare termică. Alicote ADN de intrare au fost incubate cu complex proteic His-MBD2b/MBD3L1 recombinant urmat de captare cu margele magnetice acoperite cu proteină G. Secvențele genomice Vegfc și Angpt2 au fost recuperate din baza de date a genomului șoarecelui NIH (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore), incluzând caracteristicile genei (insulele CpG și locațiile exonilor/intronilor). Pentru fiecare insulă CpG au fost proiectate și sintetizate mai multe perechi de grunduri, iar amplificarea PCR a fost efectuată așa cum este descris în detaliu în textul SI.

Fosfocolina hepatică maternă.

Fosfocolina este forma de depozitare labilă a colinei în ficat și este un indicator excelent al stării colinei dietetice (76). A fost testat folosind cromatografie lichidă - ionizare prin electrospray - spectrometrie de masă diluată cu izotopi așa cum s-a descris anterior (77).

Analize statistice.

Pentru expresia genică, analiza a fost efectuată folosind Instrumentul software pentru expresia relativă - Solvent multiplu REST-MCS versiunea 2 (gratuit de pe site-ul http://www.gene-quantification.de/rest.html) care utilizează o realocare fixă ​​pereche test de randomizare. Toate analizele statistice ale nivelurilor epitopului și ale determinărilor arborelui vascular au fost efectuate utilizând software-ul JMP (V 2; Institutul SAS, Cary, NPC) cu teste ANOVA și Tukey-Kramer. Datele sunt prezentate ca medie ± SE.

Mulțumiri

Mulțumim Dr. Robert Bagnell, Jr., pentru asistența sa la microscopie. Mulțumim și dr. Scott Olenych pentru asistența sa la microscopie. Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Institutele Naționale de Sănătate AG09525, DK55865 și DK56350 (către S.H.Z.) și Pilot Grant ES010126-08 (către M.G.M.)

Note de subsol

    1 Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: steven_zeiselunc.edu .

Contribuțiile autorului: M.G.M. și S.H.Z. cercetare proiectată; M.G.M. și C.N.C. cercetări efectuate; S.H.Z. a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; M.G.M., C.N.C. și S.H.Z. date analizate; și M.G.M., C.N.C. și S.H.Z. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.