Jenny A. Pape

Colleen R. Newey

Haley R. Burrell

Audrey Workman

Katelyn Perry

2 Departamentul de Fiziologie și Biologie a Dezvoltării, Universitatea Brigham Young, Provo, UT 84602, SUA; [email protected] (K.P.); ude.uyb@namkib_nimajneb (B.T.B.)

Benjamin T. Bikman

2 Departamentul de Fiziologie și Biologie a Dezvoltării, Universitatea Brigham Young, Provo, UT 84602, SUA; [email protected] (K.P.); ude.uyb@namkib_nimajneb (B.T.B.)

Laura C. Bridgewater

Julianne H. Grose

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Diabetul și sindromul metabolic aferent sunt o epidemie din ce în ce mai mare în societatea actuală. În 2015, 9,4% din populația Statelor Unite avea diabet, iar estimarea sindromului metabolic era mult mai mare, la 30% [1,2,3]. Caracterizat printr-o combinație de tensiune arterială crescută, glicemie crescută, exces de grăsime corporală în jurul taliei și niveluri anormale de trigliceride, sindromul metabolic crește riscul de boli de inimă, accident vascular cerebral și diabet [1]. Rata crescândă a acestor boli se datorează parțial unei schimbări globale către alimente bogate în energie, bogate în grăsimi și cu un conținut scăzut de nutrienți, combinate cu o scădere a activității fizice [4]. Deoarece aceste modificări afectează corpul în ansamblu, ele provoacă, de asemenea, procesele celulare din corp, deoarece acesta încearcă să se adapteze noilor nutrienți și niveluri de activitate. Senzorii nutrienți joacă un rol esențial în adaptarea la aceste niveluri noi, monitorizând constant nutrienții celulari și reglând căile celulare pentru a menține homeostazia [5,6]. Când apare dereglarea în căile de detectare a nutrienților, se dezvoltă multe boli umane, cum ar fi diabetul și sindromul metabolic.

Aici caracterizăm efectele moleculare ale kinazei PAS asupra respirației și metabolismului trigliceridelor, precum și modul în care kinaza PAS modifică aceste căi ca răspuns la dietă și sex. Acest studiu a utilizat teste de respirație celulară, Western blot pentru abundența proteinelor în lanțul de transport al electronilor și abordări metabolomice trigliceridice. Pentru a determina efectul dietei la șoarecii PASK -/-, am investigat adăugarea de zahăr la dieta HF raportată anterior (o dietă bogată în grăsimi bogată în zahăr, dietă HFHS). Această dietă oferă condiții în care PAS kinaza poate fi mai activă (cu conținut ridicat de zahăr), reflectând în același timp mai precis dieta occidentală a societății actuale (cu conținut ridicat de zahăr și cu conținut ridicat de grăsimi [22]). În plus, luăm în considerare sexul (femelă versus șoareci de sex masculin) atunci când caracterizăm efectele moleculare ale kinazei PAS, care nu a fost raportată anterior. Aceste descoperiri vor ajuta la înțelegerea efectelor PAS kinazei, precum și a unei diete HFHS asupra metabolismului, aruncând lumină asupra căilor care contribuie la boli precum sindromul metabolic și diabetul.

2. Materiale și metode

Animale: C57BL/6 (Charles River Laboratories Wilmington, MA, SUA) Șoarecii PASK -/- au fost donați cu generozitate de Jared Rutter (Universitatea din Utah) și au fost descriși anterior [18]. Tipul sălbatic C57BL/6 au fost obținute de la Charles River Laboratories Wilmington, MA. Șoarecii de tip sălbatic masculin și feminin și șoareci PASK -/-, în funcție de vârstă, generați de șoareci de reproducere PASK +/−, au fost plasați pe o dietă HFHS (D12266Bi Condensed Milk Diet from Research Diets - 16,8% kcal protein, 31,8% kcal grass, 51,4 % kcal carbohidrați - în principal zaharoză, cazeină lactică și amidon de porumb) sau dietă normală (NC) (Teklad Rodent Diet 8604 de la Envigo - 32% proteine, 14% grăsimi, 54% carbohidrați - în principal făină de soia decorticat) la vârsta de 12 săptămâni și menținută pe dietă pentru un total de 25 de săptămâni. Șoarecii au fost cazați la cel mult 5 șoareci/cușcă în funcție de sex, genotip și dietă atribuită într-o casă de animale convențională. Hrana și apa erau disponibile în mod liber, iar șoarecii erau pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Brigham Young (numerele de protocol 13-1003 prezentate de L.C.B.).

Proiectarea studiului: Proiectarea s-a bazat pe caracterizarea șoarecilor masculi PASK -/- din dieta HF unde șoarecii au fost plasați în dieta HF la 12 săptămâni, iar 12-24 șoareci din fiecare grup au fost folosiți pentru a obține semnificația statistică a mai multor fenotipuri inclusiv greutatea corporală [18]. Studiul conține 8 grupe experimentale, inclusiv dieta WT NC masculină și feminină, dieta WT HFHS, dieta PASK +/− NC, dieta PASK +/− HFHS care au fost menținute în dieta HFHS timp de 25 de săptămâni înainte de recoltarea țesuturilor. Au fost necesari mai mulți șoareci de sex feminin decât femele din cauza țesuturilor limitate (cum ar fi țesutul hepatic pentru testul trigliceridelor comparativ cu testul consumului de oxigen). În figura S1 este prezentată o descriere a tuturor animalelor utilizate în acest studiu.

Testele de respirație: țesutul hepatic și mușchiul solei au fost recoltate și utilizate imediat pentru testele de respirație. Consumul de O2 a fost determinat utilizând un oxigraf O2K (Oroboros Instruments Corp., Innsbruck, Austria) așa cum s-a descris anterior [23]. Țesuturile au fost tocate cu un bisturiu și permeabilizate cu saponină (50 ug/ml). O rată de respirație de bază a fost determinată în fiecare cameră de respirație și apoi probele au fost adăugate. Respirația a fost măsurată urmând protocolul substrat-decuplare-inhibitor-titrare (SUIT): s-au adăugat glutamat, malat și succinat (GMS) pentru a evalua fluxul de electroni complex I și II. S-a adăugat apoi ADP (2,5 mM) pentru a determina capacitatea de fosforilare oxidativă (GMSD). În urma colectării datelor, analiza varianței cu trei factori (ANOVA) a fost efectuată utilizând software-ul JMP Pro14 cu testul post-hoc Tukey pentru comparații cu trei și doi factori și testul t pentru studenți pentru comparații cu un factor.

Testele trigliceridelor: Probele de ficat de șoarece au fost omogenizate în 110 pl de PBS-Triton. Nivelurile de trigliceride hepatice au fost măsurate folosind kitul colorimetric/fluorometric de cuantificare a trigliceridelor BioVision (Milpitas, CA, SUA) conform protocolului producătorului, iar absorbanța a fost măsurată la 530-590 nm. Concentrația de proteine ​​a fost determinată utilizând reactivul de testare Pierce Coomassie Plus (Bradford) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA). ANOVA cu trei factori a fost efectuat utilizând software-ul JMP Pro14 cu testul post-hoc Tukey pentru analiza interacțiunii cu trei și doi factori și testul t pentru studenți pentru analiza cu un factor.

Analiză statistică: ANOVA cu trei factori a fost utilizat pe tot parcursul studiului pentru a analiza efectele sexului, genotipului și dietei, cu diferențe specifice enumerate pentru fiecare metodă. În cazul în care au fost utilizați doar șoareci masculi, ANOVA cu doi factori a fost utilizat pentru a analiza efectele genotipului și ale dietei. ANOVA factorială a fost efectuată folosind software-ul JMP Pro14 (versiunea 14.0) cu testul post-hoc Tukey utilizat pentru analiza cu trei factori (sex, genotip și dietă) și cu doi factori (sex și genotip, sex și dietă, genotip și dietă) și testul t al elevilor utilizat pentru analiza cu un singur factor (sex, genotip sau dietă). Analiza factorilor combinați este indicată prin „*”. De exemplu, „sex și genotip” este scris este sex * genotip.

3. Rezultate

3.1. Șoarecii cu deficit de kinază PAS prezintă o respirație crescută atunci când se iau o dietă normală Chow (NC)

Studiile anterioare au raportat un fenotip hipermetabolic pentru șoarecii PASK -/- pe o dietă HF, incluzând creșterea aportului de O2 la animale întregi și a producției de CO2 [9]. Acest fenotip se poate datora creșterii respirației în țesuturile periferice. Prin urmare, am măsurat ratele consumului de oxigen celular în mușchiul solei feminin și masculin, un mușchi compus în principal din fibre oxidative lente, precum și în țesutul hepatic feminin și masculin (Figura 1). Țesutul soleului atât al șoarecilor PASK -/- femele, cât și al celor masculi a prezentat o creștere tendențială a ratei de respirație bazală pe dieta NC comparativ cu șoarecii WT după analiza cu trei factori (sex, dietă, genotip). Au fost utilizate analize cu doi factori și un factor pentru a determina dacă vreun factor a contribuit în mod semnificativ la această creștere a tendințelor. Analiza cu doi factori utilizând factori combinați, cum ar fi sexul și genotipul (sexul * genotipul, sexul * dieta sau genotipul * dieta) nu au evidențiat nicio interacțiune semnificativă a factorilor, dar o analiză ulterioară cu un factor a relevat că genotipul PASK -/- a fost în principal responsabil pentru creșterea semnificativă a respirației (a

Creștere de 1,5 ori), cu sex sau dietă fără efecte semnificative (Figura 1 A, D, AGA). În plus, s-a observat un efect dramatic asupra capacității de fosforilare oxidativă (GMSD) în țesutul soleus al șoarecilor PASK -/- dietă NC masculină, care a arătat o creștere de 2 ori în comparație cu WT în țesutul soleului (Figura 1 A, GMSD ). Un ANOVA cu trei factori, urmat de o analiză cu doi factori, indică sexul * genotipul și genotipul * ca principali factori care contribuie la această creștere, sugerând o interacțiune complexă a acestor factori (Figura 1 C, D). Combinate, rezultatele mușchilor solei sunt în concordanță cu creșterea consumului de oxigen al întregului corp la șoarecii PASK -/- raportați pentru întregul animal pe o dietă HF [9]. În comparație, ratele consumului de oxigen din ficat au prezentat diferențe mici în comparație cu soleul. Șoarecii WT au prezentat o respirație bazală scăzută ca răspuns la dieta HFHS, cu dependență principală de interacțiunea cu dieta genotip * în analiza cu doi factori (Figura 1 E). În plus, au existat dependențe principale de sex (o creștere la bărbați) și dietă (o scădere a HFHS) în analiza cu un factor pentru capacitatea de fosforilare oxidativă a ficatului (Figura 1 F).

deficitul

3.2. Scăderea proteinelor complexe I este observată în dieta HFHS

Pentru a investiga mecanismele moleculare din spatele capacității crescute de fosforilare bazală și oxidativă în țesutul soarelui PASK -/- șoareci, analiza Western blot a fost utilizată pentru a cuantifica subunitățile proteice ale lanțului de transport central al electronilor, inclusiv NDUFA9 (complexul I), SDHA (complexul II, 70), UQCRC2 (complexul III, nucleul II), COX IV (complexul IV, subunitatea IV) și ATP5A (subunitatea complexă V alfa) (Figura 2). Șoarecii masculi au fost utilizați datorită amplorii crescute a efectelor respiratorii observate (vezi Figura 1). Cuantificarea acestor 5 complecși ai lanțului de transport de electroni relevă o diferență semnificativă la șoarecii HFHS PASK -/- în comparație cu NC WT pentru complexul I (Figura 2 A). O altă analiză ANOVA cu un singur factor a arătat că această diferență se datorează dietei și nu genotipului, dieta HFHS scăzând complexul I (Figura 2 B). Astfel, efectele PAS kinazei asupra respirației bazale sau a capacității de fosforilare oxidativă la șoarecii masculi pot să nu fie detectabile prin testul nostru Western blot. De exemplu, efectele pot fi asupra altor subunități ale acestor complexe sau în alte căi, sau pot fi modificări post-translaționale, așa cum se poate aștepta adesea pentru o protein kinază.

Cuantificarea a 5 complecși ai lanțului de transport de electroni utilizând mușchiul soleu omogenizat nu relevă diferențe semnificative la șoarecii masculi cu deficit de kinază PAS (PASK -/-) în comparație cu WT. (A) Țesutul Soleus a fost omogenizat și analizat prin western blot folosind Cocktail-ul anticorp OxPhosBlue Native WB (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA) conținând monoclonal de șoarece NDUFA9 (complex I), SDHA (complex II), UQCRC2 (complex III, nucleu II), Anticorpi COX IV (complex IV, subunitate IV) și ATP5A (subunitate alfa complex V). Concentrația de proteine ​​a fost determinată înainte de încărcare utilizând reactivul de testare Pierce Coomassie Plus (Bradford) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Aceeași probă de control (cntrl) a fost încărcată pe fiecare gel pentru normalizarea între geluri. (B) Parcele de analiză cu un singur factor (genotip sau dietă) a complexului I. (C) Sunt prezentate western blots reprezentative pentru fiecare complex. Fiecare replică biologică n> 4 a fost rulată în duplicat. Barele de eroare reprezintă SEM. ANOVA cu doi factori (genotip și dietă) a fost efectuat folosind software-ul JMP Pro14 cu testul t al elevilor efectuat pe diferențe semnificative, * p -/- Șoarecii au prezentat rezistență la acumularea de trigliceride hepatice atunci când au fost plasate pe o dietă HFHS

3.4. Masculină PASK -/- Șoarecii rezistă la acumularea de trigliceride hepatice într-o manieră relativ nespecifică

Spre deosebire de funcția respiratorie, rolul kinazei PAS în reglarea acumulării hepatice de trigliceride este cel mai evident la șoarecii masculi din dieta HFHS (Figura 3 E). Șoarecii masculi WT au prezentat o creștere dramatică a nivelurilor de trigliceride hepatice atunci când au fost incluși în dieta HFHS, în timp ce șoarecii masculi PASK -/- nu au prezentat nicio creștere apreciabilă. Acest efect a fost similar cu cel raportat pentru șoarecii PASK -/- din dieta HF [18]. Șoarecii femele, în schimb, par să fie mai rezistenți la acumularea de trigliceride hepatice ca răspuns la dieta HFHS (Figura 3 E). Rezultatele noastre sunt în concordanță cu rapoartele anterioare potrivit cărora șoarecii femele WT sunt mai rezistenți la acumularea de trigliceride în dieta HFHS [27]. Acest lucru sugerează că diferențele de sex pot umbri rolul kinazei PAS la femei.

Așa cum s-a prezis din datele trigliceridelor, șoarecii masculi au prezentat o creștere a greutății corporale totale, precum și tampon de grăsime retroperitoneală și gonadală (% din greutatea corporală) în dieta HFHS, în timp ce nu am observat o creștere semnificativă a șoarecilor femele (Figura 3). Cu toate acestea, deficitul de kinază PAS nu a afectat greutatea corporală sau greutatea tamponului de grăsime, deoarece a afectat acumularea de trigliceride. Când analizăm datele combinate pentru șoareci femele (care au afișat doar modificări foarte mici în masa corporală totală, acumularea de grăsime sau acumularea de trigliceride hepatice), se pare că dieta HFHS are un efect foarte limitat asupra metabolismului feminin. Acest studiu evidențiază modul în care dieta și efectele genetice pot fi mascate de diferențele de sex, făcând esențială continuarea studiilor asupra kinazei PAS la șoareci de sex masculin și femele, pentru a înțelege cu adevărat modul în care funcționează la ambele sexe.

S-a demonstrat că kinaza PAS este activată de glucoză ridicată în celulele insulelor pancreatice cultivate [14] și că este reglată și de nivelurile de glucoză din drojdie [28], stimulându-ne interesul pentru dieta HFHS care se apropie mai mult de dieta occidentală și tinde să fie abundent în sirop de porumb și produse lactate bogate în fructoză [22]. În acest studiu, efectele respiratorii observate la șoarecii PASK -/- versus șoareci WT au apărut în dieta NC, în timp ce efectele trigliceridelor au fost cele mai semnificative în dieta HFHS. În plus față de variabilitățile experimentale discutate mai sus, aceste rezultate pot indica reglarea diferențială a funcțiilor PAS kinazei, în concordanță cu protein kinaze care reglează zeci de substraturi cu funcții alternative. Ele pot reflecta, de asemenea, căi redundante care maschează deficitul de kinază PAS sau adaptările genetice care au avut loc la acești șoareci knockout [29,30,31]. Astfel de adaptări sunt mai puțin susceptibile de a ne ascunde datele despre trigliceride, deoarece s-a demonstrat că inhibarea farmacologică a kinazei PAS protejează împotriva acumulării hepatice de trigliceride hepatice induse de dietă la șobolani [13].

5. Concluzii

Aici am investigat efectele unei diete HFHS, sex și deficit de kinază PAS asupra metabolismului respirator, a greutății corpului, a grăsimilor și a ficatului, precum și a acumulării hepatice de trigliceride. Deficitul de kinază PAS a dus la creșterea respirației bazale (

De 1,5 ori) în țesutul soleului și pentru șoarecii masculi, o capacitate crescută de fosforilare oxidativă (de 2 ori) atunci când urmează o dietă NC. Pentru șoareci WT, dieta HFHS a scăzut respirația bazală în țesutul hepatic. Deși deficiența de kinază PAS nu părea să protejeze șoarecii masculi de creșterea în greutate, a scăzut semnificativ acumularea de trigliceride hepatice în dieta HFHS, șoarecii masculi PASK -/- având o scădere de 2,7 ori în comparație cu șoarecii WT. Șoarecii de sex feminin păreau protejați atât de creșterea în greutate, cât și de acumularea de trigliceride hepatice în dieta HFHS, care poate masca efectele kinazei PAS în aceste căi. Aceste rezultate consolidează PAS kinaza ca un regulator al respirației celulare și al acumulării hepatice de trigliceride, fenotipuri asociate cu diabetul și sindromul metabolic.

Mulțumiri

Vă mulțumim special lui James Cox și John Alan Maschek de la Universitatea din Utah Metabolomics Core Facility pentru analiza trigliceridelor. Mulțumim, de asemenea, studenților Brigham Young University care au asistat cu grijă de șoareci, inclusiv Jeralyn Franson, Andrew Rees, Alistair Hilton, Daniel Arens, Nidhi Choksi, Kai Li Ong și Brittany Pielstick. Această lucrare a fost susținută de Departamentul de Microbiologie și Biologie Moleculară al Universității Brigham Young și de Colegiul de Științe ale Vieții.

Materiale suplimentare

Următoarele sunt disponibile online la http://www.mdpi.com/2072-6643/10/12/1990/s1, Figura S1: O relatare a tuturor șoarecilor utilizați în acest studiu, inclusiv numărul șoarecilor pentru acest studiu, genotipul, sexul, dietă, rate de consum de oxigen în țesutul soleului (OCR soleus), rate de consum de oxigen în țesutul hepatic (ficat OCR), western blot cu lanț de electroni (ETC WB), săptămâna 1 și săptămâna 25 BW (greutate corporală), greutate hepatică, grăsime retroperitoneală greutate (RetroFat), greutate gonadică a grăsimii, trigliceride totale (TG total), spectrometrie de masă trigliceridică (TG MS). Figura S2: Nivelurile de ATP ale țesutului solei izolate de la șoareci WT și PASK -/- pe o dietă normală (NC) sau bogată în grăsimi cu conținut ridicat de zahăr (HFHS) nu sugerează diferențe semnificative. Figura S3: Cifre de analiză pentru ANOVA cu trei factori a greutăților corpului șoarecilor și a trigliceridelor.

Contribuțiile autorului

Pentru articolele de cercetare cu mai mulți autori, trebuie furnizat un scurt paragraf care specifică contribuțiile lor individuale. Următoarele afirmații ar trebui utilizate „conceptualizare, J.A.P., L.C.B. și J.H.G; metodologie, J.A.P., C.R.N., H.R.B., A.W., B.T.B. L.C.B. și J.H.G; validare, J.A.G.; analiză formală, J.A.P., A.W., K.P., B.T.B. L.C.B. și J.H.G; anchetă, J.A.P., C.R.N., H.R.B., A.W., K.P. B.T.B. L.C.B. și J.H.G; resurse, B.T.B. L.C.B. și J.H.G; organizarea datelor, J.A.P., C.R.N., H.R.B., A.W., B.T.B. și L.C.B.; scris - pregătire originală a proiectului, J.A.P. și J.H.G.; scriere - recenzie și editare, J.A.P. C.R.N., B.T.B., L.C.B. și J.H.G; vizualizare, J.A.P., B.T.B.; supraveghere, J.A.P., A.W., H.R.B., B.T.B., L.C.B. și J.H.G; administrarea proiectului, L.C.B. și J.H.G; achiziție de finanțare, L.C.B. și J.H.G.

Finanțarea

Această cercetare a fost finanțată de către Institutul Național de Sănătate Grant R15 GM100376-01 (JHG) și printr-o subvenție de la Centrul Simmons de Cercetare a Cancerului Universității Brigham Young (JAP).