Veterans Administration Medical Center, Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Francisco 94121; și

Veterans Administration Medical Center, Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Francisco 94121; și

Administrația Națională pentru Aeronautică și Spațiu - Centrul de Cercetare Ames, Moffett Field, California 94035

Administrația Națională pentru Aeronautică și Spațiu - Centrul de Cercetare Ames, Moffett Field, California 94035

Veterans Administration Medical Center, Departamentul de Medicină, Universitatea din California, San Francisco 94121; și

Abstract

microgravitația asociată cu zborurile spațiale duce la un deficit de masă osoasă la oameni și animale (15, 18). La șobolani, răspunsul osteopenic la microgravitație este asociat cu scăderea numărului de osteoblasti, scăderea formării osoase și întârzierea maturării osoase (4, 15). Modificări similare pot fi induse la nivelul membrelor posterioare ale șobolanului prin creșterea membrelor posterioare (3, 4, 6, 7, 27). Deși osteoblastul pare a fi principalul mediator al osteopeniei în aceste modele, mecanismul de bază pentru inhibarea osteoblastelor este neclar. Descărcarea scheletului poate reduce numărul de celule osteoprogenitoare sau poate inhiba proliferarea acestora, după cum sugerează scăderea numărului de osteoblasti în osul descărcat (7) și proliferarea scăzută a osteoblastilor de cultură izolați de oasele descărcate (12, 27). Diferențierea osteoblastelor poate fi, de asemenea, inhibată, așa cum sugerează inhibarea mineralizării și maturarea osului descărcat (3, 6) și expresia modificată a genelor asociate cu diferențierea osteoblastelor în osul descărcat (4).

Protocoale animale și prelucrarea țesuturilor.

A fost efectuat un experiment separat pentru a examina efectele creșterii membrelor posterioare asupra proliferării BMSC și asupra activității AP. Șobolanii au fost ridicați la nivelul membrelor posterioare timp de 0 sau 5 zile (n = 12/grup), iar celulele lor de măduvă tibială au fost îndepărtate și combinate pentru a produce patru bazine independente de celule per grup, fiecare dintre care a inclus celulele de măduvă tibială stângă și dreaptă de la trei animale. Celulele au fost cultivate în plăci cu șase godeuri, așa cum este descris mai jos, timp de până la 28 de zile pentru a examina cursul de proliferare și activitatea enzimei AP.

Metode de cultură celulară.

Izolarea ARN-ului.

După 10, 15, 20 și 28 de zile de cultură, ARN-ul total a fost izolat din fiecare bazin de celule tibiale cu un kit ARN Stat-60 (TelTest, Friendswood, TX). ARN a fost diluat în apă tratată cu dietilpirocarbonat, iar concentrația și puritatea au fost evaluate cu un spectrofotometru Uvikon (Research Instruments International, San Diego, CA). ARN a fost electroforizat pe un gel de agaroză SeaKem 1% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) conținând bromură de etidiu și vizualizat sub lumină ultravioletă (UV) pentru a-i confirma integritatea. Douăzeci de micrograme de ARN total din fiecare piscină au fost transcrise invers în ADNc folosind primeri oligo (dT) și un kit de transcriere inversă GIBCO Superscript II (GIBCO).

Clonarea șabloanelor de ADNc concurente pentru QC-PCR.

QC-PCR.

Gena GAPDH a fost utilizată pentru a controla potențialele variații ale eficienței transcrierii inverse între diferitele grupuri de ADNc. Nivelurile GAPDH au fost determinate în triplicat pentru toate grupurile de ADNc, iar datele pentru c-fos, AP și expresia genei osteocalcinei au fost apoi normalizate la niveluri de GAPDH și exprimate ca nanograme pe micrograme de GAPDH. Înainte de transcriere inversă, alicote de ARN au fost supuse analizei Northern blot cu o sondă GAPDH (datele nu sunt prezentate). Această analiză a demonstrat că expresia genei GAPDH nu a fost influențată de creșterea membrelor posterioare sau de durata în cultură și a fost astfel o genă de menaj validă pentru a controla potențialele variații ale eficienței transcripției inverse între cele 36 de grupuri de ADNc independente.

Proliferarea celulară și teste de activitate AP.

Mineralizarea in vitro.

După 28 de zile de cultură, vasele de 10 cm conținând BMSC femurale au fost clătite cu soluție salină tamponată cu fosfat și fixate timp de 1 oră cu 10% Formalin. După ce culturile fixe au fost clătite cu apă distilată, au fost colorate timp de 5 minute cu roșu de alizarină 1% în etanol 2% pentru a dezvălui mineralul. Culturile au fost apoi clătite de cinci ori cu apă distilată pentru a îndepărta pata legată slab. Nodulii colorați rezultați au fost prea numeroși pentru a se cuantifica cu exactitate, astfel încât pata a fost solubilizată timp de 30 de minute la temperatura camerei cu 0,5 N HCl-5% dodecil sulfat de sodiu (SDS). Pata solubilizată a fost îndepărtată de pe plăci și absorbanta a fost măsurată într-un spectrofotometru la 415 nm. Pentru fiecare animal, au fost analizate și mediatizate cinci feluri de mâncare replicate de 10 cm, iar valorile medii pentru șase animale au fost calculate pentru fiecare grup. Experimentele preliminare au demonstrat că absorbanța a fost legată liniar de cantitatea de roșu de alizarină eluată în intervalul măsurat în aceste experimente.

analize statistice.

Diferențele dintre animalele crescute la nivelul membrelor posterioare și cele încărcate în mod normal au fost determinate cu o analiză a varianței în două direcții (ANOVA) utilizând SigmaStat (Jandel Scientific Software, San Rafael, CA).

Cinci zile de creștere a membrelor posterioare au condus la o scădere semnificativă a greutății fără grăsime a femurului (P

Tabelul 1. Efectul creșterii membrelor posterioare asupra greutății corporale, greutății lipidice a femurului și concentrației serice de calciu ionizat

Valorile sunt medii ± SE. HLE, elevația membrelor posterioare.

* În mod semnificativ mai puțin decât controlul (0 zile HLE) și 2 zile HLE,P † În mod semnificativ mai mare decât controlul, P

inhibă

FIG. 1.Expresia lui c-fos ARNm de celule stromale din măduva osoasă cultivate (BMSC). Reacția în lanț cantitativă competitivă a polimerazei (QC-PCR) a fost utilizată pentru a cuantifica c-fos Nivelurile de ARNm în triplicat pentru fiecare grup de ADNc și standardizate la niveluri de gliceraldehid fosfat dehidrogenază (GAPDH) în același grup. Deschideți bare, comenzi [0 zile înălțimea membrului posterior (HLE)]; bare gri, 2 zile HLE; și bare hașurate, 5 zile HLE. Grupul HLE de cinci zile este semnificativ mai mic decât grupurile HLE de 0 zile [analiza varianței în 2 direcții (ANOVA),P

Expresia ARNm AP a fost semnificativ crescută în celulele osteoprogenitoare izolate de la șobolani cu 5 zile de creștere a membrelor posterioare, comparativ cu martorii (Fig.2). Cea mai mare parte a acestei expresii crescute s-a manifestat în timpul timpurilor timpurii în cultură (10 și 15 zile), iar creșterea generală pe parcursul perioadei de cultură a fost de 61% comparativ cu martorii (P

FIG. 2.Exprimarea ARNm fosfatazei alcaline (AP) de către BMSC cultivate. QC-PCR a fost utilizat pentru a cuantifica nivelurile AP mARN de trei ori pentru fiecare grup de ADNc și standardizat la niveluri de GAPDH în același grup. Bare deschise, comenzi (0 zile HLE); bare gri, 2 zile HLE; și bare hașurate, 5 zile HLE. Grupul HLE de cinci zile este semnificativ mai mare decât grupul HLE de 0 zile (ANOVA cu 2 căi, P


FIG. 3.Exprimarea mRNA osteocalcinei de către BMSC cultivate. QC-PCR a fost utilizat pentru a cuantifica nivelurile de ARNm de osteocalcină în triplicat pentru fiecare grup de ADNc și standardizat la niveluri de GAPDH în același grup. Bare deschise, comenzi (0 zile HLE); bare gri, 2 zile HLE; și bare hașurate, 5 zile HLE. Grupul HLE de cinci zile este semnificativ mai mic decât grupul HLE de 0 zile (ANOVA cu 2 căi, P


FIG. 4.Efectul descărcării scheletului asupra mineralizării in vitro. BMSC femurale au fost cultivate timp de 28 de zile în medii care conțin acid ascorbic (50 μg/ml) și β-glicerofosfat (10 mM). Culturile au fost fixate și colorate cu roșu de alizarină, care a fost solubilizat cu 0,5 N HCI-5% SDS. Absorbanta colorantului solubilizat a fost masurata la 415 nm. * Grupul HLE de cinci zile a fost semnificativ mai mic decât grupul control (0 zile HLE, P

Cinci zile de creștere a membrelor posterioare au fost suficiente pentru a provoca modificări semnificative în diferențierea și mineralizarea celulelor osteoprogenitoare cultivate. Prin urmare, am examinat efectele a 5 zile de creștere a membrelor posterioare asupra proliferării și activității AP a acestor celule. Numărul de celule a fost determinat prin colorarea violetului cristal și densitatea inițială de placare a diferitelor grupuri (lazilele 3, 4, și 5 a culturii) s-a dovedit a fi aceeași în cele două grupuri (vezi Fig. 5,medalion). Deziua 7a existat o scădere mică, dar constantă, a numărului de celule în culturile de la șobolanii cu membră posterioară în comparație cu martorii, iar această diferență a avut tendința de a crește în timp. Culturile de la șobolani crescuți la nivelul membrelor posterioare au ajuns la o pauzăziua 21, după cum este demonstrat de un platou al curbei de creștere, în timp ce, în culturile martor, numărul celulelor era încă în creștere la ziua 28. Scăderea numărului de celule din culturile de la șobolanii cu membră posterioară a fost semnificativă (P

FIG. 5.Proliferarea culturilor BMSC izolate din martor (•) și tibia de 5 zile ridicată a membrelor posterioare (▴) în timp. Culturile au fost fixate și colorate cu cristal violet, a cărei absorbanță a fost măsurată spectrofotometric la 590 nm.Medalion prezintă o scară extinsă a timpurilor timpurii în cultură. Numărul de celule din culturile de la șobolani cu creștere a membrelor posterioare a fost semnificativ mai mic decât culturile martor (cu ANOVA cu 2 căi,P


FIG. 6.Absolut (A) și relativă (B) niveluri de activitate AP în BMSC izolate de martor (•) și 5 zile tibiale crescute la nivelul membrelor posterioare (▴).A: activitatea medie AP a fost determinată spectrofotometric pe plăci cu 6 godeuri și exprimată ca absorbanță la 410 nm/ml. B: activitatea medie AP pe celulă a fost calculată prin împărțirea absorbanței la 410 nm la absorbția la 590 nm utilizată pentru determinarea numărului de celule. Activitatea AP a fost semnificativ redusă în culturile de șobolani crescute la nivelul membrelor posterioare, atât în ​​termeni absoluți, cât și în termeni relativi, cu ANOVA cu 2 căi (P

Gravitatea induce încărcarea mecanică a oaselor purtătoare de greutate, care este necesară pentru menținerea pe termen lung a arhitecturii scheletice normale. Natura semnalului biologic care mediază mecanotransducția osoasă este slab înțeleasă, dar este clar că descărcarea scheletului modifică semnificativ metabolismul osos. Descărcarea scheletului scade numărul osteoblastelor, rata de formare osoasă, masa osoasă, maturarea oaselor și rezistența mecanică (3, 6, 7, 15, 22, 25, 26). Celulele din linia osteoblastelor sunt responsabile pentru formarea osoasă și sunt cunoscute ca răspunzând la încărcarea mecanică (8, 14). Aceste celule, care includ celule osteoprogenitoare, osteoblaste și osteocite, sunt cei mai evidenți candidați pentru medierea răspunsului scheletic la descărcare. Este important să se elucideze răspunsul biologic al acestor celule la descărcarea scheletului înainte ca cineva să poată înțelege natura semnalelor mecanice la care răspund.

Proliferarea scăzută a celulelor osteoprogenitoare izolate din osul descărcat este în concordanță cu scăderea observată a expresiei c-fos, o genă care este asociată cu proliferarea osteoblastelor (11, 17). Scăderea indusă de descărcare în c-fosexpresia sugerează că activitatea proliferativă scăzută a BMSC-urilor are loc de-a lungul căii lor de diferențiere și nu este limitată la primele etape ale recrutării osteoprogenitorilor. Scăderea cu 80% a c-fos expresie la ziua 28 în culturile de la șobolani cu 5 zile de creștere a membrelor posterioare este o dovadă suplimentară că aceste celule pot avea un potențial proliferativ redus și pot ajunge la pauză mai devreme decât martorii.

Osteoblastele imature sintetizează matricea osoasă organică, care este apoi mineralizată pe măsură ce diferențierea progresează. Osteoblastele imature se caracterizează prin nivelurile lor ridicate de producție de colagen de tip I și expresia ridicată a genei și proteinelor AP (1, 13, 17, 24). Inhibarea diferențierii osteoblastelor se poate manifesta printr-o creștere relativă a populației acestor celule imature. S-a demonstrat că greutatea inhibă diferențierea osteoblastelor in vivo (20, 21), iar această inhibare poate explica modificările care apar la nivelul întregului os după descărcarea scheletului. Aceste modificări includ creșterea concentrației de colagen (16), mineralizarea scăzută (6, 15, 25), scăderea raportului calciu-hidroxiprolină (6, 23) și creșterea ARNm AP în osul descărcat (4). În studiul de față, am demonstrat o creștere specifică a nivelului expresiei AP mARN la BMSC cultivate izolate din tibii care au fost descărcate timp de 5 zile. Acest rezultat este în concordanță cu nivelul crescut de ARNm AP observat în tibiile de șobolan întreg descărcate de zborul spațial și de creșterea membrelor posterioare (4).

Activitatea enzimei AP a fost redusă prin creșterea membrelor posterioare, atât la nivelul întregii culturi, cât și pe bază de celulă. Activitatea AP a fost raportată anterior ca fiind redusă în celulele izolate de femuri care au fost descărcate prin neurectomie sciatică (9). În studiul de față, discepția aparentă între expresia AP mARN și activitatea enzimei AP are mai multe explicații potențiale. ARNm-ul AP crescut indus de descărcare nu poate fi tradus cantitativ în proteină sau activitatea catalitică a proteinei AP poate fi inhibată după descărcare. Mai mult, nivelurile de ARNm AP s-au dovedit anterior a fi influențate de un factor de stabilizare a ARNm inductibil (10), indicând un sistem complex de reglare posttranscipțională a AP. Este tentant să speculăm că reglarea activității enzimei AP poate contribui la răspunsul osteoblastului la descărcare.

Capacitatea de a forma o matrice mineralizată în cultură este poate cel mai important indice al osteoblastelor bine diferențiate. Expresia crescută a ARNm AP și expresia scăzută a ARNm osteocalcin în oasele descărcate sugerează că o proporție mai mare de osteoblaste rămâne în stadiul incipient al sintezei matricei și sunt întârziate în progresia lor normală către mineralizarea activă. Am abordat această întrebare prin colorarea culturilor BMSC femurale de 28 de zile cu roșu de alizarină, care dezvăluie noduli de celule osoase mineralizate. BMSC-urile izolate din femurele descărcate de 5 zile au format cu 40% mai puține minerale în comparație cu martorii, ceea ce indică faptul că descărcarea scheletului in vivo duce la deteriorarea mineralizării in vitro. Acest rezultat este în concordanță cu datele in vivo care demonstrează că descărcarea scheletului determină o mineralizare scăzută și un raport crescut de calciu-hidroxiprolină (6, 23, 25). Aceste date susțin ipoteza că descărcarea scheletului scade diferențierea osteoblastelor și demonstrează utilitatea acestui model pentru studierea efectelor imponderabilității asupra diferențierii osteoblastelor.

Aceste date contrastează cu cele obținute de Machwate și colab. (12), care a raportat că 14 zile de creștere a membrelor posterioare nu au modificat fenotipul osteoblastului in vitro. În studiul nostru, animalele au fost ridicate la nivelul membrelor posterioare timp de 2 sau 5 zile. Studiile anterioare indică faptul că efectele descărcării scheletice asupra formării osoase la șobolanul în creștere sunt tranzitorii. După 5 zile de creștere a membrelor posterioare, formarea osoasă, acumularea de calciu în os și concentrația serică de 1,25 (OH) 2D3 au scăzut. Cu toate acestea, toți parametrii revin la niveluri normale după 12-14 zile de creștere continuă a membrelor posterioare, indicând o recuperare a formării osoase în ciuda descărcării continue a acestor animale tinere (6, 7). Prin urmare, osteoblastele izolate din tibii după 14 zile de creștere a membrelor posterioare s-ar putea să nu fie de așteptat să difere substanțial de celulele martor.

În concluzie, am demonstrat că celulele osteoprogenitoare izolate din tibiile șobolanilor care au fost ridicate la nivelul membrelor posterioare timp de 5 zile au exprimat semnificativ mai puțin c-fosARNm, mai mult ARNm AP și mai puțin ARNm osteocalcin decât celulele din tibiile încărcate în mod normal. Modificările exprimării genelor cu 5 zile de descărcare au fost, de asemenea, însoțite de scăderi ale proliferării, activității AP și mineralizării, comparativ cu culturile martor. Modificările exprimării genei osteoblastelor și ale fenotipului după descărcare sunt în concordanță cu o deplasare către o populație de osteoblasti mai puțin matură, sugerând o inhibare a diferențierii celulelor osteoprogenitoare cu descărcarea scheletului. Aceste date demonstrează, de asemenea, că celulele osteoprogenitoare cultivate păstrează o „memorie” a istoricului lor anterior de încărcare in vivo, indicând faptul că acest model este valoros pentru studierea efectelor descărcării scheletice asupra funcției osteoblastelor in vitro.

Acest studiu a fost susținut de Grantul Național de Aeronautică și Administrație Spațială NAGW-4460.

REFERINȚE

NOTE AUTORULUI

Adresa pentru solicitări de reeditare: D. D. Bikle, Veterans Administration Medical Center (111N), 4150 Clement St., San Francisco, CA 94121.