Corespondență cu: Bin Xu, dr., Profesor, Laboratorul cheie de acupunctură integrată și medicamente afiliate la Ministerul Educației din China, Universitatea de Medicină Chineză din Nanjing, nr. 1338 Xianlin Road, Nanjing 210023, provincia Jiangsu, China. moc.anis@xuuuux

Telefon: + 86-25-86798095 Fax: + 86-25-86798095

Abstract

SCOP: Stabilirea unui nou model de constipație a șoarecilor.

METODE: Animalele au fost împărțite aleatoriu în trei grupuri și administrate intragastric 0-4 ° C ser fiziologic (grup rece cu gheață) sau 15-20 ° C ser fiziologic (grup martor salin) zilnic timp de 14 zile sau au fost lăsate netratate (grup martor gol )). Scaunele au fost colectate la 3-24 ore după tratament pentru a înregistra greutățile umede și uscate și forma scaunului. Au fost efectuate experimente de propulsie intestinală și timpul de defecare a fost măsurat timp de șase zile continuu după suspendarea tratamentelor. Expresiile PGP9.5 au fost detectate de imunohistochimie.

REZULTATE: Pe baza procentului de modificări ale greutății scaunului comparativ cu valoarea inițială (înainte de iritare) în 9-14 zile, modificările greutății scaunului au fost clasificate în trei niveluri. Fiecare nivel arată o stare corporală diferită, care este starea I (fără modificări: plus sau minus 5%), starea II (ușor scăzută: 5% -15%) și starea III (scăzută: 15% -25%). În starea III, între ziua 9-14, greutățile scaunelor au scăzut cu 15% -25% comparativ cu valoarea inițială și s-au modificat cu o rată> 10% comparativ cu valorile martorului gol, iar scaunele au devenit mici și uscate. În plus, funcțiile intestinale au degenerat la aceste animale, iar expresia pozitivă a PGP9.5 a scăzut semnificativ în jejun, ileon și plexul mienteric de colon proximal.

CONCLUZIE: Iritarea cu soluție salină rece ca gheața este o metodă stabilă, repetabilă în construirea modelului de constipație la șoareci pentru explorarea opțiunilor de patogeneză și tratament ale constipației, iar schimbarea greutății și mărimii scaunului poate servi ca instrument util pentru a judeca succesul modelului de constipație sau nu.

Tipul de bază: Stabilirea de modele animale stabile este foarte importantă pentru studierea patogeniei bolii pentru a dezvolta strategii de prevenire și tratament. Dovezile din cercetările anterioare au arătat că iritarea recurentă și cronică a apei reci la nivelul stomacului poate inhiba motilitatea gastro-intestinală. În acest studiu, am concluzionat că iritarea cu soluție salină rece ca gheața la șoareci este o metodă stabilă, repetabilă în construirea modelului de constipație a șoarecilor.

INTRODUCERE

Constipația, care însoțește diferite boli, este un simptom al defectelor care stau la baza fie în tranzitul masei fecale prin intestin, fie în defecație, o tulburare gastrointestinală funcțională diagnosticată frecvent. Se asociază de obicei cu tulburări de motilitate gastro-intestinală, care se caracterizează printr-o serie de simptome gastro-intestinale complexe în absența obstrucției mecanice a tractului gastro-intestinal. În general, se acceptă faptul că afectarea motilității gastro-intestinale și a paresteziei viscerale formează baza patologică și fiziologică majoră a disfuncției gastro-intestinale [1-3]. Având în vedere insuficiența datelor clinice disponibile, sunt necesare modele animale pentru a studia patogenia constipației și a dezvolta strategii de prevenire și tratament și este necesar să se dezvolte și modele optimizate [4].

În ultimii ani, multe abordări au fost utilizate pentru a produce constipație la animale experimentale in vivo. Cu toate acestea, cea mai mare parte a muncii a fost efectuată la șobolani. În comparație cu șobolanii, șoarecii au o toleranță mai mică și nu li se pot administra medicamente iritante pe termen lung. Cercetarea la șoareci oferă multiple avantaje, inclusiv eficiența economică și disponibilitatea unui număr mai mare de tulpini de rasă pură sau manipulate genetic (transgenice și knockout). Mai mult, trăsăturile anatomice murine și dezvoltarea embrionară sunt similare cu cele ale oamenilor, iar genomurile prezintă, de asemenea, un grad ridicat de omologie [5]. Modelele de șoareci oferă o versatilitate mai mare pentru studiul funcțiilor genelor umane și patogeneza bolii decât modelele de șobolani. Prin urmare, în acest studiu, ne-am propus să producem un model stabil de constipație la șoareci, să studiem patogeneza constipației și să explorăm opțiuni de tratament mai bune.

MATERIALE ȘI METODE

Animale

Șoarecii C57BL/6J (mascul SP-grade, mascul de 3 săptămâni, 20-25 g) au fost achiziționați de la Centrul de Cercetare Animal Model al Universității Nanjing (Nanjing, China, număr de licență: SCXK 2013-0005). Hrana și apa erau disponibile ad libitum, iar animalele erau găzduite în condiții de mediu controlate. Toate manipulările experimentale au fost întreprinse în conformitate cu Principiile de îngrijire a animalelor de laborator și Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, publicat de National Science Council, China.

Grupuri și tratamente

Șoarecii au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri: un grup tratat cu soluție salină 0-4 ° C (grup rece cu gheață, n = 30), un grup normal de hrănire (martor gol, n = 10) și un 15-20 ° C grup tratat cu soluție salină (martor salin, n = 10), numerotat aleatoriu și crescut în cuști individuale care permiteau accesul normal la alimente și apă. Plasa de sârmă a fost utilizată pentru a facilita separarea și colectarea scaunelor. Pentru a elimina influența ritmurilor biologice, administrările intragastrice au fost efectuate la 8:00 o dată pe zi timp de 14 zile. Șoarecii din grupurile martor răcite cu gheață și saline au fost inițial administrate fie cu gheață, fie cu soluție salină la temperatura camerei, respectiv, la o doză de 0,2 ml/șoarece, iar apoi doza a crescut cu 0,05 ml/șoarece la fiecare 5 zile. Șoarecii martor martor au fost crescuți în mod normal fără administrare intragastrică. Animalele au fost crescute și monitorizate în mod normal timp de încă 6 zile după încetarea administrărilor intragastrice.

Colectarea și examinarea scaunului

În perioada de 3-24 ore după administrarea intragastrică, scaunul a fost colectat cu cupe ceramice. După colectare, modificările în forma scaunului (dimensiunea peletei) au fost observate și înregistrate înainte de cântărire. Apoi, fiecare cană ceramică a fost cântărită pentru a determina greutatea umedă utilizând o balanță electronică. După uscare într-un cuptor cu microunde (căldură medie) timp de 6 minute, cana a fost cântărită din nou pentru a determina greutatea uscată.

Măsurarea funcției intestinale

Pregătirea țesuturilor

Când s-a terminat intervenția de 14 zile, intestinul subțire (jejun și ileon) și specimenele de țesut de colon proximal (aproximativ 1 cm lungime) au fost îndepărtate după 12 ore de post. Fiecare segment a fost deschis de-a lungul marginii mezenterice și spălat de două ori în soluție salină. Când țesuturile mezenterice și conținutul intestinului au fost îndepărtate, segmentele au fost imediat fixate prin imersiune în 4% Para formaldehidă timp de 24 de ore. Apoi, au fost prelucrate pentru încorporarea parafinei în vid și tăiate la o grosime de 10 μm.

Imunohistochimie

Secțiunile au fost deparafinizate în xilen și hidratate într-o soluție gradată de etanol. Activitatea peroxidazei endogene a fost blocată cu 3% peroxid de hidrogen. După trei clătiri în soluție salină tamponată cu fosfat 0,01 mol/L (PBS; pH 7,2), legarea nespecifică a fost blocată cu 5% albumină serică bovină (BSA) timp de 30 de minute la 37 ° C. Anticorpii primari pentru PGP9.5 (1: 1000) au fost aplicați pe secțiuni și fiecare specimen a fost incubat într-o cameră umedă peste noapte la 4 ° C. Diapozitivele au fost spălate de trei ori în PBS și incubate cu hreanperoxidază (HRP) -Polimer anti-șoarece/iepure lgG timp de 90 de minute la 37 ° C. După spălare în PBS de trei ori, localizarea proteinei țintă a fost vizualizată prin incubarea secțiunilor timp de 5-10 minute în soluție de 3,3-diaminobenzidină proaspăt preparată (DAB). Lamele au fost spălate din nou, contracolorate în hematoxilină și deshidratate. Specificitatea anticorpului a fost confirmată prin control negativ în absența tratamentului cu anticorpi primari. Doi observatori au evaluat lamele folosind un microscop optic Olympus FV500 (Olympus, Tokyo, Japonia). Imunocolorarea pozitivă a fost evaluată la 5 câmpuri vizuale aleatorii la o mărire de 400. Densitatea medie a expresiei pozitive a fost evaluată utilizând software-ul de analiză a imaginii.

Materiale și medicamente

Materialele utilizate în acest studiu au inclus soluție salină (injecție cu clorură de sodiu; Nanjing Chemical Reagent Co., Jiangsu, China), tablete de domperidonă (Xi'an Janssen Pharmaceutical Ltd, Xi'an, China), plasă de sârmă (pentru a facilita separarea și colectarea scaunelor) )), o balanță electronică de precizie (Sartorius Co, Beijing, China), gumă de salcâm (pudră arabică de gumă; BASF Chemical Co, Tianjin, China), pulbere de carbon negru și roșu (toner color; Sanheng Information Technology Co, Guangzhou, China), și cupe ceramice (rezistente la temperaturi ridicate, rază: 2 cm, înălțime: 3,5 cm). Anticorpi primari pentru imunohistochimie: PGP9.5 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), Anticorpi secundari: HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit (Boster Biotech, Wuhan, China)

Suspensiile de carbon roșu (negru) au fost preparate după cum urmează: guma de salcâm (100 g) a fost adăugată la 800 mL de apă și a fiert până a fi transparentă. Apoi, soluția de mai sus a fost amestecată cu pulbere de carbon roșie (neagră) (50 g) și a fiert de trei ori. După răcire, fiecare soluție a fost diluată cu apă la 1000 ml și depozitată la 4 ° C. Soluțiile au fost agitate înainte de utilizare.

analize statistice

tabelul 1

Performanța diferitelor grupuri după tratament

GrupuriTratamentePerformanță (după tratament)
Grup rece ca gheața0-4 ° C soluție salinăStatul I, statul II și statul III
Controlul salin15-20 ° C ser fiziologicNu există tipuri de state
Control golHrănirea normalăNu există tipuri de state

În timpul experimentelor consecutive în serie, am putut observa trei stări diferite ale corpului (I, II și III) la șoarecii din grupul rece ca gheața, în timp ce nu au fost observate astfel de modificări la șoarecii din grupele C. În starea I, greutățile umede și uscate greutățile înregistrate între d 9-14 s-au modificat cu -5% până la 5% comparativ cu valoarea inițială și s-au modificat cu o rată de 10% în comparație cu valorile corespunzătoare ale grupului de control gol. În această stare, diferențele în greutatea scaunului dintre șoarecii din grupul de gheață rece și șoareci din grupul martor martor au fost semnificative statistic.

Modificări ale scaunului în toate grupurile

După iritarea cu soluție salină rece ca gheața, am putut observa trei stări diferite (I, II și III), iar simptomele de constipație au fost observate în starea III. În comparație cu grupul martor martor (Figura (Figura 1A 1A și B) și valorile grupului martor salin (Figura (Figura 1C 1C și D), greutățile scaunelor la șoarecii din grupul III cu răcire cu gheață au scăzut în timpul experimentelor, iar normalitatea a fost atinsă 6 d după terminarea iritației. În comparație, după un tratament similar cu soluție salină la temperatura camerei (grupul martor salin), astfel de modificări nu au fost observate, iar greutatea scaunului șoarecilor grupului martor salin nu a diferit semnificativ de grupul martor gol corespunzător. valori (Figura (Figura 1E 1E și F).

model

Modificări ale formelor de scaun. A: Scala de formă a scaunului Bristol; B: conținutul de apă al scaunelor crește și se lipesc împreună, similar cu scara Bristol tip 5 sau 6 a șoarecilor State I; C: Unele scaune aderă la rețeaua de sârmă la fel ca tipul 6 sau 7, indicând o diaree ușoară; D: Compararea lungimii totale estimate pentru 25 de pelete de scaun (LS25).

Imagine a scaunelor din diferite grupuri. În primul rând din fiecare grup, scaunele au fost similare tipului 3 sau 4. Din al doilea rând, scaunele au fost aranjate secvențial în același număr (n = 25) la rând. A: la 7 zile; B: la 14 zile; C: la d 16; D: la 20 de zile.

Efecte asupra funcțiilor intestinului subțire în timpul experimentelor

Experimentele de propulsie intestinală cu carbon au arătat că distanțele cu care a fost propulsat carbonul negru au scăzut semnificativ la șoarecii de stare III, comparativ cu grupul martor martor la ambii d 15 (47,03% ± 6,18% față de 61,94% ± 4,80%, P = 0,0211, Figura Figura 4A 4A și B) și d 20 (56,11% ± 4,23% față de 63,73% ± 4,68%, P = 0,0379, Figura 4C 4C și D) și a existat o creștere a ratelor de propulsie a carbonului în grupul martor salin la d 15 comparativ cu martorul martor grup (71,18% ± 4,81% vs 61,94% ± 6,20%, P = 0,0169). În experimentele ulterioare, șoarecii de stare III folosind pretratarea suspensiilor de domperidonă, ratele de propulsie a carbonului au fost crescute comparativ cu șoarecii de stare III fără utilizarea domperidonei la ambii d 15 (65,22% ± 5,43% față de 44,52% ± 8,11%, P = 0,0051, Figura Figura 4E 4E și F) și d 20 (63,14% ± 6,73% față de 52,12% ± 4,05%, P = 0,0196, Figura 4E 4E și F) și nu diferă semnificativ de valorile grupului de control gol.

Măsurarea timpului necesar defecării primei pelete de scaun care conține indicatori. A: Toate grupurile au fost măsurate la 15 zile; B: Toate grupurile au fost măsurate la 20 de zile; C: statul III comparativ cu cei tratați cu domperidonă și grupul martor martor la d15; D la 20 d (n = 5 pentru fiecare grup), b P d P (Figura6A), 6A), ileon (Figura (Figura6D) 6D) și colon proximal (Figura (Figura6G) 6G) plexus mienteric în grupul martor gol. Analiza statistică a arătat, după administrarea intragastrică a tratamentului cu soluție salină rece ca gheața, că densitatea medie a expresiei PGP9,5-pozitive a scăzut semnificativ în jejun (0,6185 ± 0,07 vs 0,4343 ± 0,09, P = 0,0092, Figura 6B 6B și C), ileon (0,9095 ± 0,07 vs 0,7685 ± 0,08, P = 0,0166, Figura Figura 6E 6E și F) și colonul proximal (0,4925 ± 0,07 vs 0,3381 ± 0,04, P = 0,0019, Figura Figura 6H 6H și I) plexul mienteric comparativ cu grupul martor gol.

Efecte asupra neuronilor totali-expresia proteinei PGP9.5 în colorarea imunohistochimică. Țesutul cu depuneri granulare maronii a fost o reacție pozitivă (după cum indică săgețile; -: 50 μm, mărire × 400). A, B: In jejun; D, E: În ileon; G, H: În colonul proximal; C, F, I: Comparația densității medii a expresiei pozitive PGP9.5 între două grupuri. o P 10% comparativ cu valoarea grupului de control gol.

Șoarecii, care prezintă o toleranță mai mică la medicamente, nu pot fi tratați pe termen lung cu medicamente iritante. Cu toate acestea, disponibilitatea crescută a knockout-ului genelor gastro-intestinale și a modelelor transgenice de șoarece oferă un domeniu mai mare de investigare a patogeniei și a tratamentului constipației. Prin urmare, am explorat stabilirea unui model de constipație a șoarecilor și am construit preliminar un model simplu de constipație a șoarecelui repetabil. În acest model fără medicamente, am folosit iritații cu soluție salină rece ca gheața pentru a induce constipația. Este remarcabil faptul că am constatat că șoarecii bătrâni de 3-4 săptămâni sunt cei mai adecvați, astfel intervenția ar trebui realizată înainte de maturitate, ceea ce înseamnă că acest model nu se aplică studiului de corelație al constipației senile. Acest model a necesitat doar un ciclu scurt de intervenție (14 zile), iar normalitatea a fost atinsă la 6 zile după întreruperea iritației, ceea ce este convenabil și practic și evită efectele secundare datorate iritației prea puternice a medicamentelor și, prin urmare, prezintă un model atractiv pentru a studia patogenia și patogeneza care stau la baza constipației și explorează opțiunile de tratament.

COMENTARII

fundal

Constipația este un simptom al unei afecțiuni subiacente care afectează motilitatea intestinului. Având în vedere lipsa datelor clinice disponibile, sunt necesare modele animale și este necesar să se dezvolte modele optimizate. În modelele de constipație existente, majoritatea sunt efectuate la șobolani. Prin urmare, autorii au explorat stabilirea unui model de constipație a șoarecilor și au construit preliminar un model simplu de constipație a șoarecelui repetabil.

Frontierele cercetării

Iritarea persistentă a apei reci la nivelul stomacului poate inhiba motilitatea gastro-intestinală la șobolani, sugerând că aportul de apă rece este un factor de risc pentru constipație. Cu toate acestea, s-au încercat puține eforturi pentru a stabili un model de constipație a șoarecilor cu iritație cronică și recurentă a apei reci.

Inovații și descoperiri

Iritarea cu soluție salină rece ca gheața la șoareci ar putea induce disfuncții gastro-intestinale. Multe metode au fost stabilite pentru evaluarea funcției intestinale, care arată o capacitate de mimare a stării bazate pe simptome umane. Această metodă este convenabilă și practică.

Aplicații

Prezintă un model atractiv și ajută la studierea patogeniei și patogeniei care stau la baza constipației și la explorarea opțiunilor de tratament.

Evaluare inter pares

Acest studiu acoperă un subiect interesant. Este suficient de nou și se adaugă canonului nostru de cunoaștere despre fiziopatologia și opțiunile terapeutice ale constipației.

Note de subsol

Susținut de Programul Național de Cercetare de Bază 973 Program, Nr. 2011CB505206; Fundația Națională pentru Științe Naturale din China, nr. 81202744 și Nr. 81373749.

Declarație a comitetului de revizuire instituțională: Acest studiu a fost revizuit și aprobat de Comitetul de revizuire instituțională a Universității de Medicină Chineză din Nanjing, Nanjing, China.

Declarația comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor: Toate manipulările experimentale au fost întreprinse în conformitate cu principiile de îngrijire a animalelor de laborator și Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, publicat de Consiliul Național al Științei, China; iar studiul a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea de Medicină Chineză din Nanjing.

Declarație privind conflictul de interese: Autorii declară că nu există conflicte de interese legate de acest studiu.

Declarație de partajare a datelor: nu sunt disponibile date suplimentare nepublicate.

Acces deschis: acest articol este un articol cu ​​acces deschis care a fost selectat de un editor intern și complet evaluat de către evaluatori externi. Acesta este distribuit în conformitate cu licența Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), care permite altora să distribuie, să remixeze, să adapteze, să construiască pe această lucrare necomercial și să licențieze lucrările derivate în termeni diferiți, cu condiția ca lucrarea originală este citată în mod corespunzător, iar utilizarea este necomercială. A se vedea: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Evaluarea inter pares a început: 20 septembrie 2015

Prima decizie: 14 octombrie 2015

Articol în presă: 19 noiembrie 2015

P- Recenzor: De Ponti F, Jadallah KA, Pasalar M S- Editor: Qi Y L- Editor: Ma JY E- Editor: Wang CH