Abstract

fundal

Acidul folic (FA) este un antioxidant care poate reduce generarea de specii reactive de oxigen și poate contonda disfuncția cardiacă în timpul ischemiei. Am emis ipoteza că suplimentarea cu FA previne fibroza cardiacă și disfuncția cardiacă indusă de obezitate.

Metode

Șoarecii C57BL6/J în vârstă de șase săptămâni au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD), dietă normală (ND) sau un HFD suplimentat cu acid folic (FAD) timp de 14 săptămâni. Funcția cardiacă a fost măsurată cu ajutorul unui examen ecocardiografic transtoracic. Analiza fenotipică a inclus măsurători ale greutății corpului și inimii, a conținutului de glucoză din sânge și de homocisteină (Hcy) și a stării de stres oxidativ cardiac.

Rezultate

Consumul de HFD a ridicat nivelul glicemiei la repaus alimentar și a cauzat obezitate și mărirea inimii. Suplimentarea FA la șoarecii hrăniți cu HFD a dus la scăderea conținutului de glucoză din sânge, greutate cardiacă și conținut de Hcy în țesuturi cardiace. De asemenea, am observat o disfuncție sistolică cardiacă semnificativă atunci când șoarecii au fost supuși hrănirii cu HFD, după cum se indică printr-o reducere a fracției de ejecție a ventriculului stâng și scurtarea fracționată. Cu toate acestea, tratamentul FAD a îmbunătățit funcția cardiacă. Suplimentarea cu FA protejată împotriva fibrozei cardiace indusă de HFD. În plus, HFD a crescut concentrația de malondialdehidă a țesutului cardiac și a scăzut nivelurile de enzime antioxidante, glutation și catalază. Consumul de HFD a indus stres oxidant miocardic cu ameliorare prin tratament FA.

Concluzie

Suplimentarea cu FA scade semnificativ nivelul de glucoză din sânge și conținutul de Hcy al țesutului cardiac și inversează disfuncția cardiacă indusă de HFD la șoareci. Aceste îmbunătățiri funcționale ale inimii pot fi mediate de atenuarea stresului oxidativ și a fibrozei miocardice.

fundal

Prevalența obezității crește rapid la nivel mondial [1, 2]. Obezitatea este privită ca o tulburare a echilibrului energetic cu expansiune și disfuncție inadecvată a țesutului adipos. Obezitatea determină o prevalență a diabetului de tip 2 și a bolilor cardiovasculare care cauzează hipertrofie ventriculară stângă (VS), accident vascular cerebral și insuficiență cardiacă [3, 4]. Mai mult, studiile acumulate au demonstrat că obezitatea afectează remodelarea cardiacă cu anomalii structurale și funcționale [5, 6]. Cu toate acestea, mecanismele de bază care contribuie la aceste modificări rămân neclare din cauza unei interacțiuni complexe a factorilor hemodinamici, neuroendocrini și metabolici care cauzează hipertrofie cardiacă, apoptoză celulară și fibroză interstițială [7].

S-a considerat că stresul oxidativ și inflamația sunt implicate în patogeneza și progresia multor forme de boli cardiovasculare [8, 9]. Mai multe studii au indicat că stresul oxidativ joacă un rol esențial în dezvoltarea cardiomiopatiei induse de obezitate [10, 11]. Hiperglicemia legată de obezitate și anomaliile metabolice determină producerea de specii reactive de oxigen (ROS) în celulele vasculare și cardiomiocite [12]. În timpul rezistenței la insulină înainte de apariția diabetului, acumularea ROS poate fi găsită în țesutul cardiac [13], contribuind la disfuncția cardiacă prin peroxidarea lipidelor, remodelarea matricei extracelulare, afectarea mitocondrială și modificarea proteinelor de cuplare [14]. În plus, fibroza și inflamația cardiacă sunt ameliorate prin tratamentul cu antioxidanți în inima diabetică [15, 16]. Terapiile care vizează reducerea stresului oxidativ și îmbunătățirea apărării antioxidante au fost folosite pentru a preveni disfuncția cardiacă în bolile cardiovasculare [17].

Acidul folic (FA) este o vitamină B (vitamina B9) care facilitează transferul unităților de 1-carbon în mai multe reacții biosintetice pentru două funcții celulare majore, și anume, metilarea ADN și contribuția unităților formil la sinteza nucleotidelor [18]. O meta-analiză a studiilor controlate randomizate a arătat că suplimentarea cu FA poate reduce riscul bolilor cardiovasculare [19]. Activitatea antioxidantă este implicată în aceste efecte ale FA asupra tulburărilor cardiovasculare [20]. Studiile anterioare au raportat că pretratamentul FA bluntă disfuncția miocardică în timpul ischemiei și ameliorează leziunile de reperfuzie și cuplate la conservarea fosfaților cu energie ridicată, reducând generarea ROS și moartea celulelor ischemie-reperfuzie [21].

Hiperhomocisteinemia este asociată cu un risc ridicat de boli cardiovasculare, iar fortificarea folatului dietetic scade nivelul Hcy plasmatic [22]. Interesul față de FA pentru tratamentul bolilor cardiovasculare provine din rolul său critic în transformarea Hcy în metionină [23]. FA prezintă un efect antioxidant împotriva ROS și ameliorează hiperhomocisteinemia și disfuncția sa endotelială asociată. Mai mult, efectul antiinflamator al FA se manifestă prin scăderea nivelului unor mediatori inflamatori la subiecții supraponderali, sugerând un potențial rol terapeutic al FA în protecția împotriva bolilor cardiovasculare [24]. Deși suplimentarea cu FA influențează stresul oxidativ, inflamația și metabolismul Hcy, efectul direct al FA asupra cardiomiopatiei legate de obezitate nu a fost încă studiat.

În studiul de față, am emis ipoteza că suplimentarea cu FA la șoarecii obezi induși de HFD previne dezvoltarea disfuncției cardiace prin reducerea stresului oxidant, a inflamației și a fibrozei miocardice asociate. Pentru a testa această ipoteză, șoarecii au fost hrăniți cu HFD timp de 14 săptămâni în prezența sau absența suplimentării cu FA. Ulterior, șoarecii au fost măsurați pentru creșterea în greutate, glicemia, funcția cardiacă și histologia inimii.

Metode

Animale și design experimental

Șoareci masculi C57BL/6J de șase săptămâni au fost obținuți de la Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. (Beijing, China) și găzduit într-o cameră cu temperatură controlată (23 ± 2 ° C) cu ciclu de lumină - întuneric de 12 h. Șoarecii au primit acces ad libitum la alimente și apă. Animalele au fost alocate aleatoriu la o dietă normală (ND aproximativ 10% energie sub formă de grăsime) sau o dietă bogată în grăsimi (HFD aproximativ 60% energie sub formă de grăsime) sau la un HFD suplimentat cu acid folic (FAD, 20 μg/mL, Sigma) în apă potabilă timp de 14 săptămâni. Studiul actual a folosit o doză de FA suplimentară, care este de cinci ori mai mare decât necesarul dietetic bazal al șoarecilor [25]. Greutatea corporală a fost măsurată săptămânal. Pentru testarea toleranței la glucoză în repaus alimentar, șoarecii au fost postiti peste noapte, apoi sângele venos a fost extras prin tăierea cozii. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu glucometre Accu-Check (Roche Applied Science, Penzberg, Germania). Funcția cardiacă, morfologia, parametrii biochimici, peroxidarea lipidelor miocardice și profilurile de stres oxidativ au fost evaluate la vârsta de 20 de săptămâni. Toate procedurile efectuate au fost în acord cu Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Institutul de Pediatrie al Capitalei (CIP 2016032).

Analiza țesutului cardiac

Țesuturile cardiace au fost omogenizate într-un tampon fosfat de 50 mmol/L (pH 7,2) conținând 0,1 mmol/L acid etilendiamină tetraacetic și centrifugat la 5000 ×g timp de 10 min pentru testul ulterior. Supernatantul omogenatului de țesut cardiac a fost colectat pentru analiza FA și Hcy. Măsurătorile au fost efectuate folosind un kit de analiză imunosorbentă legată de enzime (ELISA) FA și Hcy (Cusabio, Wuhan, China) conform instrucțiunilor producătorilor.

Examen ecocardiografic

După 14 săptămâni de hrănire, toate animalele au fost cântărite și evaluate printr-un examen ecocardiografic transtoracic. Toate măsurătorile au fost efectuate de un tehnician orbit de experimente. Șoarecii au fost anesteziați și analizați folosind un instrument specific animalului (VisualSonics Vevo770®, Visual Sonics Inc., Toronto, Canada) [26]. Diametrele diastolice și sistolice de capăt VS și grosimea peretelui au fost obținute din trasări în modul M din măsurători mediate din șase cicluri separate. Au fost măsurate următoarele variabile structurale: diametrul intern al ventriculului stâng la diastola de capăt (LVIDd) și sistola de capăt (LVID) și grosimea peretelui posterior de la V la diastolă și sistolă. Funcția sistolică a fost evaluată pe baza scurtării fracționale a VS și a fracției de ejecție a VS.

Analiza histologică

După analize ecocardiografice, șoarecii au fost eutanasiați. Țesutul cardiac a fost, de asemenea, disecat, separat și cântărit. Secțiunile transversale ale VS au fost fixate în 10% formalină tamponată neutră și parafină încorporate. Secțiunile de parafină groase de cinci microni au fost apoi colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Tricromul lui Masson a fost utilizat pentru a detecta depunerea de colagen în țesutul cardiac. Gradul de afectare a inimii a fost examinat orbește cu ajutorul unui microscop cu lumină Leica DMRB/E (Leica Microsystems, Heerbrugg, Elveția). Mușchiul inimii și mușchiul neted vascular au fost colorate în roz, în timp ce colagenul a fost colorat în albastru.

Analiza stresului oxidativ

Țesutul cardiac a fost utilizat pentru a evalua activitatea enzimelor antioxidante, a superoxidului dismutazei (SOD) și a catalazei (CAT), a conținutului celular al glutationului antioxidant (GSH) și a peroxidării lipidelor [malondialdehidă (MDA)]. Nivelurile de conținut de enzime SOD, CAT și GSH au fost măsurate folosind un kit de testare comercializat (Beyotime Biotechnology, Beijing, China) conform instrucțiunilor producătorului. Conținutul de proteine ​​a fost determinat prin metode de acid bicinchoninic folosind un kit comercial (Solarbio, Beijing, China). Activitățile enzimatice au fost normalizate la concentrația de proteine ​​în probe.

analize statistice

Toate seturile de date sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Comparația dintre cele două grupuri a fost efectuată folosind Studentul cu două cozi nepereche t-testați folosind software-ul Prism 6.0 GraphPad (GraphPad, San Diego, CA, SUA). O valoare de p ˂ 0,05 este considerat semnificativ statistic.

Rezultate

FA a scăzut glicemia și a împiedicat mărirea inimii la șoarecii HFD

previne

Suplimentarea FA a inversat creșterea Hcy indusă de HFD

Deficiența FA în ser a fost asociată cu riscul bolilor cardiovasculare [27]. Prin urmare, am folosit concentrațiile FA de țesut ca indice al donatorilor de metil din extractele de țesut cardiac. Nu s-a observat nicio diferență la nivelurile FA între șoarecii ND și HFD. Cu toate acestea, nivelurile de țesut FA au fost semnificativ mai mari în grupul FAD comparativ cu grupurile HFD (Fig. 2a, p ˂ 0,05). Am măsurat nivelul de Hcy al țesutului cardiac, deoarece FA crește nivelul de 5-metilen tetrahidrofolat reductă, determinând o creștere a metabolismului Hcy [23]. Alimentarea cu HFD a crescut semnificativ concentrațiile de Hcy în țesutul cardiac (Fig. 2b, p ˂ 0,001). Interesant, am constatat că suplimentarea cu FA a redus nivelurile de Hcy în țesutul cardiac al șoarecilor HFD, dar nu au existat diferențe semnificative în nivelurile de Hcy între șoarecii FAD și ND (Fig. 2b, p ˂ 0,05).

Disfuncția cardiacă indusă de HFD a fost îmbunătățită prin tratamentul FA

Folosind ultrasunografie/ecocardiografie 2-D în mod M, am observat dezvoltarea dilatației cardiace la șoareci hrăniți cu HFD timp de 14 săptămâni, determinat de LVIDd. LVID-urile au fost semnificativ ridicate în grupurile HFD. LVID-urile au fost reduse semnificativ la șoarecii tratați cu FA, dar nu înapoi la șoarecii ND (Fig. 3a și b, p ˂ 0,05). De asemenea, am observat o disfuncție sistolică cardiacă semnificativă atunci când șoarecii au fost supuși hrănirii cu HFD, după cum se indică printr-o reducere a fracției de ejecție a VS și scurtarea fracționată (Fig. 3c și d, p ˂ 0,01). Șoarecii HFD au demonstrat că dilatația cardiacă proeminentă și semnificativă și disfuncția sistolică în comparație cu șoarecii ND. Deși aceste modificări au fost ameliorate prin tratamentul cu FA, șoarecii FAD nu au reușit să revină la nivelul normal (Fig. 3c și d). Dilatarea cardiacă și disfuncția cardiacă indusă de obezitate au fost îmbunătățite la șoarecii tratați cu FA (Fig. 3c și d, p FIG. 3

Suplimentarea cu FA ameliorează fibroza miocardică indusă de HFD

Pentru a investiga în continuare efectele cardioprotectoare ale suplimentării cu FA, am examinat efectele FA asupra morfologiei inimii. Colorarea HE a arătat că inimile șoarecilor hrăniți cu HFD au prezentat anomalii structurale și au crescut semnificativ degenerescența grasă a cardiomiocitelor, în timp ce acele alternanțe de șoareci hrănite cu HFD au fost ameliorate prin tratament cu FA (Fig. 4a). Cu toate acestea, nu s-au observat modificări evidente ale inflamației în rândul celor trei grupuri. Colorația suplimentară cu tricromul Masson a relevat o creștere semnificativă a acumulării de colagen și a fibrozei în inimile șoarecilor hrăniți cu HFD. Tratamentul cu FA a redus semnificativ gradul de depunere a colagenului și fibroza (Fig. 4b).

Histologie cardiacă după colorarea HE (A) și colorarea tricromă a lui Masson (b) din secțiuni din fiecare grup (mărire originală 200 ×, n = 5). ND, dieta normală; HFD, dietă bogată în grăsimi; FAD, HFD suplimentat cu FA; săgeată neagră, degenerescență grasă; săgeată gri, acumulare de colagen

Tratamentul FA a atenuat stresul oxidativ miocardic la șoarecii hrăniți cu HFD

Stresul oxidativ este asociat cu disfuncție cardiacă la modelele de cardiomiopatie legată de obezitate [10]. Pentru a evalua rolul FA în stresul oxidativ, s-a determinat starea redox cardiacă a biomarkerilor înrudiți. Analiza peroxidării lipidelor de către MDA în miocard a relevat o creștere semnificativă a grupului HFD. Suplimentarea cu FA a redus semnificativ nivelurile de MDA în comparație cu grupul HFD (Fig. 5a, p ˂ 0,05). În plus, consumul de HFD a provocat în mod evident stres oxidativ în țesutul cardiac, dovadă fiind reduse semnificativ cele mai importante enzime antioxidante GSH și CAT (Fig. 5b și c, p FIG. 5

Discuţie

Obiectivul acestui studiu a fost de a evalua efectele suplimentării cu FA asupra inimii șoarecilor obezi induși de HFD și rolul stresului oxidativ în acest scenariu. În studiul actual, șoarecii hrăniți cu HFD au prezentat o creștere în greutate mai mare comparativ cu șoarecii ND. Nivelurile de glucoză și insulină au fost semnificativ mai mari în grupul HFD, ceea ce indică rezistența la insulină și este în concordanță cu dezvoltarea diabetului de tip 2. Suplimentarea cu FA a redus nivelul glicemiei la jeun și a îmbunătățit rezistența la insulină. Mai mult, am demonstrat că suplimentul FA ameliorează disfuncția cardiacă la șoarecii obezi induși de HFD. Acest rezultat a fost însoțit de stres oxidativ cardiac scăzut, fibroză și conținut de Hcy tisular.

HFD este legat de creșterea obezității și a bolilor de inimă, în special a disfuncției sistolice, care caracterizează obezitatea timpurie/cardiomiopatia metabolică [28]. Dovezile experimentale anterioare au raportat asocierea dintre obezitate și modificări morfologice și funcționale în inimile oamenilor și animalelor [29,30,31]. Complicațiile cardiovasculare la obezitate și rezistența la insulină se manifestă adesea ca scăderea fracțională scăzută și afectarea funcției cardiomiocitelor [32]. În studiul de față, alimentarea cu HFD a indus o disfuncție sistolică cardiacă semnificativă, însoțită de LVIDd și LVID semnificativ crescute. Cu toate acestea, suplimentarea cu FA a îmbunătățit scurtarea fracțională a VS și fracția de ejecție a VS la șoarecii HFD. Această constatare indică faptul că FAD previne disfuncția cardiacă legată de obezitate la șoarecii HFD.

Au fost implicate mai multe căi în patologia disfuncției cardiace legate de obezitate, inclusiv fibroza VS, stres oxidant crescut, inflamație și modificări ale conținutului de colagen [33]. Studiile au arătat în repetate rânduri că stresul oxidativ și fibroza miocardică sunt legate de funcția sistolică cardiacă afectată la modelele de obezitate și rezistență la insulină la șoareci [34, 35]. În plus, oxidarea îmbunătățită a acizilor grași duce la o supraproducție a ROS [36], un produs secundar al peroxidării lipidelor, care joacă un rol important în stresul oxidativ crescut, precum și o energie diminuată pentru funcția miocardică [37]. Stresul oxidativ induce mai multe modificări cardiace dăunătoare, inclusiv disfuncție mitocondrială, deteriorarea ADN-ului, activarea metaloproteinazei, disfuncție celulară, fibroză miocardică și hipertrofie cardiacă [38].

Concluzii

Prezentul studiu demonstrează că suplimentul cu FA scade semnificativ nivelul de glucoză din sânge, reduce conținutul de Hcy al țesutului cardiac și protejează împotriva disfuncției cardiace legate de obezitate indusă de HFD la șoareci. Îmbunătățirile morfologice și funcționale ale inimii pot fi mediate prin ameliorarea peroxidării lipidelor și a fibrozei miocardice. Aceste observații implică faptul că suplimentarea cu FA inhibă stresul oxidativ și, prin urmare, poate servi ca o abordare potențială pentru prevenirea cardiomiopatiei legate de obezitate.