Helen N. Jones

* Departamentul de Ginecologie și Obstetrică și

grăsimi

Laura A. Woollett

* Departamentul de Ginecologie și Obstetrică și

Nicolette Barbour

* Departamentul de Ginecologie și Obstetrică și

Puttur D. Prasad

* Departamentul de Ginecologie și Obstetrică și

Theresa L. Powell

* Departamentul de Ginecologie și Obstetrică și

Thomas Jansson

* Departamentul de Ginecologie și Obstetrică și

Abstract

Creșterea excesivă a fătului are ca rezultat nașterea unui copil de vârstă mare pentru gestație (LGA), care este de obicei definit ca greutate la naștere> centil 90 și apare la aproximativ 10% din toate sarcinile (1). Copiii cu LGA prezintă un risc crescut de apariție a obezității și a sindromului metabolic în copilărie și adolescență (2, 3), contribuind astfel la incidența crescută a diabetului (4) întâlnită în prezent la nivel mondial. Deși o asociere între obezitate în timpul sarcinii și restricție de creștere intrauterină a fost raportată în câteva studii (5), rezultatul tipic în ceea ce privește creșterea fetală la sarcinile femeilor supraponderale și obeze este creșterea excesivă a fătului (6,7,8) Într-adevăr, femeile cu un indice de masă corporală crescut (IMC) sunt de 2-3 ori mai predispuși să nască un copil mare (9), ceea ce reprezintă o problemă medicală semnificativă, având în vedere că> 50% din totalul femeilor americane intră în sarcină supraponderal (IMC 25-29,9 kg/m 2) sau atârnă (IMC ≥30 kg/m 2) (9).

Aportul energetic alimentar matern, inclusiv aportul total de grăsimi, este crescut la femeile însărcinate supraponderale și obeze în primul și al treilea trimestru (10). Astfel, se creează un „ciclu vicios”, femeile supraponderale și obeze consumând o dietă bogată în energie, grăsimi și carbohidrați și dând naștere copiilor mari. Acești copii sunt mai predispuși să dezvolte obezitate și diabet mai târziu în viață și, în cazul femeilor, sunt predispuși să nască un copil mare atunci când rămân gravide (7, 8, 11). Măsurile de atenuare a creșterii excesive a fătului la aceste femei reprezintă o strategie de intervenție timpurie care ar putea contribui la o scădere a prevalenței obezității și diabetului în generațiile viitoare. Cu toate acestea, lipsa unor modele animale adecvate pentru a studia mecanismele care stau la baza creșterii excesive a fătului în aceste sarcini a împiedicat progresele în acest domeniu.

Creșterea fetală este puternic influențată de aportul de nutrienți, care este dependent de funcțiile de transport placentare. Se știe că activitatea transportorului de substanțe nutritive placentare se modifică în cazurile de creștere fetală anormală, iar aceste modificări pot contribui direct la modificări ale ratei de creștere fetală (12, 13). Excesul de creștere fetală la sarcinile complicate de diabetul de tip 1 (14), dar nu de diabetul mellitus gestațional (GDM) (15) este asociat cu o activitate crescută a transportatorului de glucoză placentară și cu expresia proteinelor. Capacitatea placentei de a transporta aminoacidul esențial leucină este crescută în GDM complicată de creșterea excesivă a fătului (16) și a sistemului placentar. S-a raportat că activitatea transportorului de aminoacizi a crescut atât în ​​diabetul de tip 1, cât și în GDM (16). Spre deosebire de aceste constatări, un studiu anterior a indicat faptul că activitatea sistemului A este redusă și activitatea sistemului L este nealterată în veziculele cu membrană plasmatică microviloză (MVM) izolate din sarcinile diabetice de tip 1 cu bebeluși LGA (17). Cu toate acestea, în prezent nu sunt disponibile date referitoare la funcția de transport placentar la sarcinile asociate cu creșterea IMC matern.

În comparație cu femeile cu IMC normal, femeile supraponderale și obeze au concentrații serice crescute de insulină, interleukină-6 (IL-6) și leptină și niveluri mai mici de adiponectină în al treilea trimestru (10, 18, 19) și multe dintre acestea modificările sunt deja prezente în primul trimestru (10). Studiile anterioare au demonstrat că leptina și insulina stimulează activitatea sistemului de transport de aminoacizi A în fragmente viloase primare și celule trofoblaste cultivate (20, 21). În mod similar, s-a dovedit că transportorii de glucoză placentară din fragmentele viloase primare obținute la începutul sarcinii sunt reglementate in vitro de insulină (22). Prin urmare, modificările nivelurilor materne ale acestor factori de reglare la femeile gravide supraponderale și obeze pot influența căile de transport ale nutrienților placentari și pot crește aportul de nutrienți la fătul în curs de dezvoltare.

Există puține, dacă există, modele animale de obezitate publicate în timpul sarcinii, care prezintă caracteristicile cheie ale condiției umane, adică creșterea adipozității materne fără diabet, niveluri crescute de hormoni metabolici materni, adiponectină scăzută și creștere excesivă a fătului. Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a dezvolta un model de șoarece alimentat cu o dietă moderat bogată în grăsimi înainte și pe tot parcursul gestației, rezultând o creștere excesivă a fătului și asociată cu un mediu reflectorizant matern care a fost găsit la femeile gravide cu IMC crescut. Odată stabilit, am folosit modelul pentru a testa ipoteza că mecanismele care stau la baza creșterii excesive a fătului au implicat un transport crescut al nutrienților placentari.

MATERIALE ȘI METODE

Animale și diete

Toate protocoalele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Cincinnati. Șoarecii femele C57/BL6 de opt săptămâni (Laboratorul Jackson, Bar Harbor, ME, SUA) au fost găzduiți 4/cușcă în carcasă cu barieră PIV și hrăniți ad libitum cu o dietă bogată în grăsimi (HF) (32% energie din grăsimi), 52% din carbohidrați și 16% din proteine; nr. Catalog D12266B) sau dieta de control (C) (11% energie din grăsimi, 73% din carbohidrați și 16% din proteine; catalog nr. D12489B) timp de 8 săptămâni. Dietele au fost achiziționate de la Research Diets (New Brunswick, NJ, SUA). Aportul zilnic de alimente a fost estimat prin cântărirea alimentelor rămase la sfârșitul fiecărei săptămâni și a fost utilizat pentru a calcula aportul caloric zilnic. După 8 săptămâni de hrănire cu aceste diete, șoarecii au fost cântăriți și împerecheați. Femelele au fost verificate zilnic pentru dopuri postcopulatorii. Prezența unui dop a reprezentat ziua embrionară (E) 0,5. La E18.5, barajele au fost cântărite și apoi utilizate fie pentru colectarea probelor de sânge și țesuturi, teste de toleranță la glucoză, fie studii de transport placentar in vivo.

Colectarea probelor de sânge și țesuturi

Izolarea MVM-urilor trofoblaste

Protocolul pentru izolarea MVM-urilor trofoblaste din placenta șoarecelui a fost adaptat de cel utilizat anterior în placenta umană (16). Toate procedurile au fost efectuate pe gheață și etapele de centrifugare au fost efectuate la 4 ° C. Omogenatele au fost centrifugate la 10.000 g timp de 15 minute; peletele au fost resuspendate, rehomogenizate în 1 ml de tampon D și centrifugate la 10.000 g timp de 10 min. Supernatantele rezultate au fost combinate și filate la 125.000 g timp de 30 de minute. Fracția de membrană brută granulată a fost resuspendată în 2 ml de tampon D și s-au adăugat 12 mM MgCl2. Suspensia a fost agitată timp de 20 de minute pe gheață. După centrifugare la 2500 g timp de 10 min, supernatantul a fost centrifugat la 125.000 g timp de 30 min. Peleta finală a fost resuspendată în tamponul D pentru a da o concentrație de proteine ​​de ± 10 mg/ml. Puritatea MVM a fost evaluată prin îmbogățirea MVM/omogenizat a fosfatazei alcaline (23) și sa dovedit a fi de 13 ± 1,49 ori (n = 16).

Western blot

Test de toleranță la glucoză

Testele de toleranță la glucoză au fost efectuate la un subset de șoareci pe E18.5 după un post de 6 ore. Șoarecii conștienți fără restricții au fost injectați i.p. cu glucoză (2 g/kg greutate corporală), iar sângele a fost prelevat în trei exemplare din vena cozii la 0, 15, 30, 60 și 90 min după încărcarea glucozei. Sângele a fost obținut prin amputarea vârfului cozii la momentul zero și prin îndepărtarea crustei plăgii la punctele de timp ulterioare. Glicemia a fost măsurată imediat folosind un glucometru Freestyle (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SUA).

Studii de transport placentar in vivo

La E18.5 barajele au fost anesteziate folosind Ketaset (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, SUA) plus inactină (Sigma-Aldrich Corp.), s-a făcut o incizie a gâtului, iar vena jugulară a fost identificată și cateterizată. Un bolus din două trasoare marcate radioactiv (50 μCi/kg [14 C] acid metilaminoisobutiric (MeAIB) și 250 μCi/kg [3 H] metilglucoză; Perkin Elmer, Waltham, MA, SUA) a fost injectat în vena jugulară. După 3 min, barajul a fost sacrificat folosind o supradoză de inactină, s-a obținut o probă de sânge arterial matern prin puncție cardiacă, s-a efectuat laparotomie și făturile au fost ucise prin decapitare. Fetusii și placentele au fost îndepărtate, cântărite și solubilizate timp de 4 ore în Biosol (National Diagnostics, Atlanta, GA, SUA). Radioactivitatea în plasma maternă și în placentele și fetuții solubilizați a fost determinată prin numărarea beta. Clearance-ul unidirecțional maternofetal (Kmf; μl · min -1 -1 g -1) pentru fiecare trasor a fost calculat după cum urmează:

unde Nx este numărat în făt, luate la momentul x când mama a fost ucisă (dpm), AUC0 - x este zona sub curba de concentrație a izotopului matern de la 0 la momentul sacrificării mamei (dpm · min · μl −1) (25), iar W este greutatea umedă a placentei (g).

Prezentarea datelor și statisticile

Datele sunt prezentate ca mijloace ± se. Pentru datele fetale și placentare, a fost calculată o medie pentru fiecare așternut, iar această medie a așternutului a fost utilizată în analiza statistică ulterioară. Astfel, n reprezintă numărul de așternuturi. Semnificația statistică a diferențelor dintre grupurile C și HF a fost evaluată folosind un test t Student nepereche. Corelațiile Pearson au fost utilizate pentru analiza multivariată. P Tabelul 1). La E18.5, barajele alimentate cu HF erau cu 12% mai grele decât barajele alimentate cu dieta C; cu toate acestea, nu a existat nicio diferență în greutatea maternă după îndepărtarea fetușilor prin cezariană (Tabelul 1). Greutatea totală a pernelor materne de grăsime a crescut cu 7% la animalele hrănite cu dieta HF (Tabelul 1). La E18,5, nivelurile materne de adiponectină au fost reduse cu 35% la barajele alimentate cu HF, iar nivelurile de leptină au crescut semnificativ cu> 80% la animalele hrănite cu dieta HF (Tabelul 1). Nu s-au observat diferențe la nivelurile materne de IL-6 (Tabelul 1), iar nivelurile de TNF-α au fost sub nivelul de detectare la toate animalele. HbA1c matern (Tabelul 1) și glicemia în repaus alimentar FIG. 1 ) au fost similare în cele două grupuri, indicând faptul că animalele hrănite cu HF nu au dezvoltat diabet. Nivelurile de insulină materne care nu depun efort la E18.5 au fost similare în cele două grupuri de dietă (Tabelul 1). Răspunsul glucozei din sânge la o sarcină de glucoză intraperitoneală a fost similar la barajele martor și la cele alimentate cu HF (Fig. 1). .

TABELUL 1.

Greutățile materne și parametrii metabolici la E18.5

Parametru C Dieta Dieta HF Semnificație a
Aport zilnic de calorii (kcal)14,82 ± 0,2516,76 ± 0,21P se. Dietele C și HF au fost hrănite la șoareci femele cu 8 săptămâni înainte și pe tot parcursul gestației. Toate măsurătorile serice au fost nedorite. o semnificație statistică a fost determinată folosind un test t Student nepereche; P se; n = 5/dieta. Dietele C (○) și HF (▪) au fost administrate șoarecilor femele cu 8 săptămâni înainte și pe tot parcursul gestației. Un i.p. s-a administrat injecție de 2 g/kg dintr-o soluție de glucoză 30%, iar măsurătorile glicemiei din vena cozii în anumite momente sunt prezentate. Nu s-a observat nicio diferență semnificativă între cele două grupuri de dietă.

Greutăți fetale, placentare și totale ale așternutului la E18.5. Valorile sunt mijloace ± se. Dietele C și HF au fost administrate șoarecilor femele cu 8 săptămâni înainte și pe tot parcursul gestației. P 3 H] metilglucoză și [14 C] MeAIB ca răspuns la dieta HF ( FIG. 3 ). Clearance-ul maternofetal unidirecțional al [3H] metilglucozei a fost crescut de 5 ori, iar clearance-ul [14 C] MeAIB a fost crescut de 10 ori în grupul HF comparativ cu grupul C. Creșterea ratelor de eliminare a placentei a fost asociată cu o creștere semnificativă a expresiei GLUT1 (de 5 ori) în MVM placentare izolate de la animale hrănite cu dieta HF ( Fig. 4 si si5). 5 ). În plus, expresia proteinei SNAT2 a crescut semnificativ (de 9 ori) la MVM de la animalele hrănite cu dieta HF (figurile 4 și 5). 5). În schimb, expresia proteinei MVM a SNAT4 nu a fost afectată de dieta HF (Fig. 4). Expresia GLUT3 a fost măsurată în omogenatul placentar total; cu toate acestea, nu s-a găsit nicio diferență între cele două grupuri de dietă (Fig. 5) .