Afiliație Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, Manchester, Regatul Unit

bacteriană

Afiliație Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, Manchester, Regatul Unit

Afiliații Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, Manchester, Regatul Unit, Departamentul de Științe Ecologice, Vrije Universiteit Amsterdam, Amsterdam, Olanda

Afiliații Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, Manchester, Regatul Unit, FrogLife, Peterborough, Regatul Unit

Afiliere Chester Zoo, Chester, Regatul Unit

Afiliație Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, Manchester, Regatul Unit

  • Rachael E. Antwis,
  • Rachel L. Haworth,
  • Daniel J. P. Engelmoer,
  • Victoria Ogilvy,
  • Andrea L. Fidgett,
  • Richard F. Preziosi

Cifre

Abstract

Citare: Antwis RE, Haworth RL, Engelmoer DJP, Ogilvy V, Fidgett AL, Preziosi RF (2014) Dieta ex situ influențează comunitatea bacteriană asociată cu pielea broaștelor cu ochi roșii (Agalychnis callidryas). PLoS ONE 9 (1): e85563. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085563

Editor: Gabriele Berg, Universitatea de Tehnologie din Graz (TU Graz), Austria

Primit: 7 octombrie 2013; Admis: 3 decembrie 2013; Publicat: 9 ianuarie 2014

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de un studiu al Consiliului de Cercetare în Biotehnologie și Științe Biologice la REA Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Comunitățile bacteriene simbiotice se găsesc frecvent în asociere atât cu animale, cât și cu plante. Adesea comunitatea bacteriană oferă un anumit avantaj gazdei în schimbul unui beneficiu reciproc, cum ar fi nutrienții și un microhabitat adecvat în care să trăiască și să se reproducă [1], [2]. Diversitatea bacteriilor joacă un rol important în determinarea stabilității și rezilienței comunității la perturbarea intrinsecă sau extrinsecă, cum ar fi stresul, schimbarea mediului sau invazia de către agenți patogeni [3] - [6]. De exemplu, Dillon și colab. [6] a demonstrat o relație inversă semnificativă între bogăția de specii a intestinului de lăcuste (Schistocerca gregaria) și creșterea bacteriilor patogene (Serratia marcescens), precum și o scădere semnificativă a numărului de indivizi infectați cu o creștere a comunității bacteriene diversitate.

Există un număr tot mai mare de cercetări care arată că comunitatea bacteriană asociată cu pielea amfibienilor poate influența susceptibilitatea gazdei la o serie de boli infecțioase (de exemplu, ref. [1], [2], [7] - [12]). Bacteriile asociate cu pielea amfibienilor pot proteja gazda de infecția patogenă prin; a) creșterea concurenței pentru spațiu și resurse; b) modificarea microambientului pielii amfibiene pentru a preveni colonizarea agenților patogeni și c) producerea de anti-microbieni care omoară sau inhibă creșterea agenților patogeni [1], [11], [13]. De exemplu, Woodhams și colab. [9] a constatat că o populație de Rana sierra persistând cu Batrochochytrium dendrobatidis (Bd; ciuperca amfibiană chytrid) din Parcul Național Yosemite (SUA) avea în mod semnificativ mai mulți indivizi cu cel puțin o tulpină bacteriană anti-Bd asociată cu pielea lor decât o populație din apropiere. de Rana muscosa care a fost naiv pentru ciuperca chytrid și ulterior a dispărut când Bd s-a răspândit în zonă. Lam și colab. [12] au comparat aceeași populație de R. sierrae cu o altă populație naivă de Bd de R. muscosa din zonă și au găsit proporții similare de indivizi în fiecare populație care găzduia cel puțin o tulpină bacteriană anti-Bd, iar această populație de R. muscosa a reușit să persiste când ciuperca chytrid a sosit un an mai târziu.

Utilizarea bacteriilor anti-Bd ca potențială apărare probiotică împotriva ciupercii chytridice este în prezent investigată [14]. S-a arătat că bacteriile probiotice potențiale se pot stabili cu succes pe pielea amfibienilor, atât direct, cât și prin transfer din mediu, cu creșteri ulterioare ale metaboliților anti-Bd pe piele și creșterea semnificativă a creșterii și supraviețuirii la expunerea la zoospori Bd [ 15] - [17]. În plus, o serie de bacterii producătoare de acid lactic care apar în mod natural pe broaștele de taur americane (Lithobates catesbeianus) au fost izolate, iar studiile in vitro sugerează că inocularea populațiilor captive cu aceste bacterii are potențialul de a preveni și/sau trata septicemia bacteriană, fie individual, fie ca probiotic cu mai multe tulpini [18] - [21]. Prin urmare, prezența asamblării corecte a bacteriilor pe pielea amfibienilor este probabil importantă pentru protejarea acestora de bolile infecțioase.

Amfibienii în sălbăticie au o expunere relativ mare la bacterii prin transmiterea mediului înconjurător (de exemplu, plante, sol, apă) și prin interacțiuni atât cu specificații (de exemplu, transferul matern sau patern și transferul în timpul împerecherii), cât și cu alte specii [2], [22] - [24]. În contrast, amfibienii captivi interacționează aproape sigur cu mai puțini indivizi, precum și se confruntă cu un mediu mai puțin divers și eterogen prin care să câștige bacterii. Ca rezultat, amfibienii captivi sunt susceptibili de a primi o expunere mai mică la o varietate de bacterii și, prin urmare, susțin o structură comunitară bacteriană cutanată mai simplă în comparație cu omologii sălbatici, făcându-i mai puțin rezistenți la boli la reintroducerea în sălbăticie. Din cunoștințele autorului, în prezent nu există studii publicate care să compare microflora nativă a populațiilor captive și sălbatice ale aceleiași specii.

Diferite condiții de creștere în captivitate (dietă, substrat, îmbogățire etc.) sunt, de asemenea, susceptibile să influențeze comunitatea microbiană. Meyer și colab. [25] au constatat că temperaturile mai reci (10-20 ° C) au dus la creșterea frecvenței de sloughing a pielii la broaștele de trestie (Rhinella marina) în comparație cu temperaturile mai calde (20-30 ° C) și că sloughing-ul pielii a dus la o abundență scăzută de bacterii pe piele. Acest lucru indică faptul că condițiile din captivitate pot influența indirect comunitatea bacteriană, deși efectele directe ale diferitelor practici de creștere sunt încă de investigat. Pentru ca tratamentele probiotice să fie eficiente, este necesară o mai bună cunoaștere a influenței potențiale a condițiilor captive ale comunităților bacteriene cutanate.

Starea nutrițională a gazdei poate influența comunitatea bacteriană prezentă din două motive; a) este probabil ca bacteriile să utilizeze substanțele nutritive din mucusul pielii amfibienilor; și b) există dovezi care sugerează că intestinul unui amfibian acționează ca un rezervor pentru bacteriile pielii [2], [26], [27]. Multe specii de amfibieni își ingerează pielea la vărsare, ingerând astfel și bacteriile cutanate, care pot fi apoi re-inoculate pe piele prin cloacă [27]. S-a demonstrat că dieta influențează comunitatea bacteriană asociată cu intestinul multor specii de insecte, precum și a altor organisme gazdă, inclusiv păstrăv curcubeu (Oncorhynchus mykiss), iguane Galapagos (Amblyrhynchus cristatus, Conolophus subscristatus și Conolophus pallidus) și oameni [28] - [32]. Dieta amfibienilor este, de asemenea, susceptibilă să influențeze supraviețuirea bacteriilor din tractul intestinal și, prin urmare, să influențeze comunitatea care este re-inoculată pe piele. Acest lucru poate modifica succesul tratamentelor probiotice, precum și potențialul de a face amfibieni în captivitate și a celor eliberați înapoi în sălbăticie mai vulnerabili sau rezistenți la infecția cu agenți patogeni.

Un aspect nutrițional de interes pentru sănătatea amfibienilor este carotenoidele dietetice [33], [34]. La vertebrate, carotenoizii sunt obținuți exclusiv din dietă și acționează ca antioxidanți în organism, precum și ca precursori ai vitaminei A [35]. În plus, carotenoizii conferă culoarea roșie, portocalie și galbenă în multe organisme, inclusiv broaște [36], [37]. În sălbăticie, amfibienii au acces la o gamă largă de insecte hrănitoare din care să câștige carotenoizi, în timp ce amfibienii captivi sunt hrăniți în general cu nevertebrate cu deficit de carotenoizi [34]. Încărcarea intestinală a insectelor hrănitoare în captivitate poate fi utilizată pentru a crește disponibilitatea carotenoizilor pentru amfibieni. Broaștele cu ochi roșii (Agalychnis callidryas) hrănite cu o dietă îmbogățită cu carotenoizi au avut o culoare roșie semnificativ mai mare în pielea lor decât cele hrănite cu o dietă fără carotenoizi [34], indicând faptul că nutrienții din dietă sunt depuși în piele și, prin urmare, pot avea o efect asupra comunității bacteriene cutanate.

Aici am folosit metode de cultivare pentru a compara comunitatea bacteriană cutanată asociată cu pielea broaștelor cu ochi roșii (Agalychnis callidryas) hrănite cu o dietă îmbogățită cu carotenoizi și o dietă fără carotenoizi. De asemenea, am identificat bacteriile la nivelul genului/speciei folosind secvențierea ADN-ului ribozomal 16S și le-am comparat cu bacteriile cultivate colectate dintr-o populație sălbatică de A. callidryas la Stația de Cercetare Las Cuevas, Chiquibul Rainforest, Belize. Am emis ipoteza că A. callidryas sălbatic ar susține un număr mai mare de specii bacteriene decât A. callidryas captiv și că ar exista diferențe în speciile bacteriene izolate. De asemenea, am emis ipoteza că A. callidryas captiv hrăniți cu o dietă bogată în carotenoizi ar susține o diversitate bacteriană semnificativ mai mare decât cei hrăniți cu o dietă fără carotenoizi.

Metode

Declarație de etică

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității din Manchester și Comitetul de Etică al Societății Zoologice din Nordul Angliei (Chester Zoo) și toate metodele au fost neinvazive. Bacteriile au fost colectate și exportate din populația sălbatică de Agalychnis callidryas cu permisiunea Departamentului Pădurilor din Belize (Numărul permisului de cercetare și export CD/60/3/12) și importate în Marea Britanie cu permisiunea DEFRA (numărul de autorizare TARP/2012/224).

Prelevarea de probe bacteriene din broaștele captive

Șaptesprezece A. callidryas crescute în captivitate (F1, provenind din comerțul cu animale de companie) au fost hrăniți cu greieri negri (Gryllus bimaculatus) încărcați cu intestine fie cu o dietă bogată în carotenoizi (5,0 mg/g; n = 10; 5 masculi, 5 femele), fie cu un carotenoid -dieta gratuită (0,0 mg/g; n = 7; 4 bărbați, 3 femele) (a se vedea [34] pentru detalii despre diete). Toate broaștele provin din același ambreiaj de ouă și au fost repartizate aleatoriu la un grup de tratament dietetic la metamorfoză. Astfel, diferențele observate în comunitățile bacteriene pot fi atribuite diferențelor de dietă numai. Observăm că acest design testează diferențele dintre comunitățile bacteriene la un anumit punct de prelevare, mai degrabă decât modul în care comunitățile bacteriene se schimbă în timp ca răspuns la adăugarea de carotenoizi în dietă.

Conversia datelor și analiza statistică

Prelevarea de probe bacteriene din broaștele sălbatice

Opt A. callidryas (patru bărbați, patru femele) au fost colectate din iazul Elegans la stația de cercetare Las Cuevas, pădurea tropicală Chiquibul, Belize (16 ° 43′N, 88 ° 59′W), plasate individual în saci de plastic și returnate la stație de cercetare. Fiecare broască a fost apoi clătită și tamponată așa cum este descris pentru animalele studiate cu dieta carotenoidă. Tuburile care conțin tampoane au fost agitate energic timp de 30 de secunde, iar conținutul a fost turnat pe plăcile de agar R2A, care au fost acoperite cu parafilm și bacterii lăsate să crească la temperatura ambiantă timp de opt zile. Probele nu au fost diluate la 10 -1 (la fel ca la broaștele captive) pentru a minimiza numărul de pași necesari pentru creșterea bacteriilor pe câmp. Deoarece scopul acestui lucru a fost de a compara identitatea bacteriilor asociate cu broaștele sălbatice și captive, este puțin probabil ca aceasta să aibă efecte semnificative asupra rezultatelor. Tampoane sterile au fost folosite pentru a alege colonii reprezentative ale fiecărui morfotip, care au fost plasate în tuburi cu șurub care conțin 1 ml de mediu de bulion R2A. Tuburile au fost apoi expediate la Universitatea din Manchester (Marea Britanie), unde conținutul tuburilor a fost turnat pe plăci proaspete de agar R2A și incubate la 25 ° C până când bacteriile au crescut. Acestea au fost apoi re-striate pentru a se asigura o cultură pură a fost obținută.

Metode moleculare și analize de secvențiere

Rezultate

Efectele disponibilității carotenoide dietetice asupra comunității bacteriene cutanate

O gamă de 8-13 morfotipuri au fost izolate per individ din broaștele hrănite cu o dietă îmbogățită cu carotenoizi, iar 6-11 morfotipuri au fost izolate per individ din broaștele hrănite cu o dietă fără carotenoizi. Modelul Adonis pentru dietă, sex și interacțiunea dietă × sex a arătat că dieta a avut un efect semnificativ asupra comunității bacteriene generale asociate cu broaște (F1.13 = 2.868, p = 0.024), dar genul (F1.13 = 0.815, p = 0,529) și dieta × sexul (F1.13 = 0,733, p = 0,618) nu. Sexul a fost ulterior eliminat din model, lăsând un efect semnificativ al dietei asupra comunității bacteriene totale (F1,15 = 2841, p = 0,014).

Barele de eroare arată ± 1 S.E.M. Un * indică o diferență semnificativă.

Barele de eroare arată ± 1 S.E.M. Un * indică o diferență semnificativă.

Identitățile morphotype sunt indicate prin numărul de acces GenBank; vezi Tabelul 1 pentru detalii. Barele de eroare arată ± 1 S.E.M.

Identitățile morphotype sunt indicate prin numărul de acces GenBank; vezi Tabelul 1 pentru detalii. Barele de eroare arată ± 1 S.E.M.

Diferențe în speciile bacteriene între populațiile captive și sălbatice

Tabelul 1 prezintă speciile bacteriene individuale izolate din A. callidryas captiv și sălbatic. Douăzeci și unu de morfotipuri din 12 familii au fost izolate din populațiile sălbatice de A. callidryas. Treisprezece morfotipuri bacteriene diferite (șase familii) au fost izolate de broaștele hrănite cu o dietă îmbogățită cu carotenoizi, iar unsprezece (cinci familii) au fost izolate de broaște hrănite cu o dietă fără carotenoizi. Doar o specie bacteriană a fost izolată atât din populațiile sălbatice, cât și din cele captive (Stenotrophomonas sp.; Izolate din captivul A. callidryas alimentat cu dieta carotenoidă), deși trei specii bacteriene izolate din broaștele captive nu au putut fi identificate din cauza datelor de secvență slabe, iar coloniile au fost nu mai este disponibil pentru rezechență. Două familii dominante de bacterii au fost izolate de A. callidryas sălbatic și captiv; Enterobacteriaceae și Staphylococcaceae (Tabelul 1). Pentru aceste două familii, mai multe specii au fost izolate de broaștele sălbatice decât captive (opt față de două și respectiv trei față de două).

Discuţie

Efectele disponibilității carotenoide dietetice asupra comunității bacteriene cutanate

Bogăția crescută a bacteriilor pe pielea broaștelor cu dietă carotenoidă comparativ cu broaștele din dieta fără carotenoizi sugerează prezența carotenoidelor ar putea îmbunătăți creșterea și/sau supraviețuirea bacteriilor atât în ​​intestin, cât și pe piele. Agalychnis callidryas își ingeră pielea la vărsare (Antwis, pers. Obs.), Și o mai mare disponibilitate a carotenoizilor în dietă poate proteja bacteriile în timp ce trec prin intestin, permițându-le astfel să fie re-inoculate pe piele. De exemplu, unele bacterii folosesc carotenoizi pentru a proteja ADN-ul, proteinele și membranele celulare de daunele cauzate de speciile reactive de oxigen care sunt produse în timpul proceselor metabolice din corpul gazdă [35], [40]. Wiggins și colab. [27] au izolat aceleași specii bacteriene din intestinul și pielea P. cinereus, iar genurile similare de bacterii se găsesc în intestinul R. catesbiana și R. pipiens ca și pe pielea altor specii de amfibieni, inclusiv A. callidryas în acest studiu (de exemplu, specii din genurile Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Flavobacterium, Klebsiella, Micrococcus, Pseudomonas și Serratia) [41] - [43]. Acest lucru sugerează că comunitățile bacteriene asociate cu pielea și curajul amfibienilor sunt de origine similară și au potențialul de a influența compoziția reciprocă.

Diferențe în speciile bacteriene între broaștele sălbatice și cele captive

Un număr mult mai mare de bacterii au fost izolate din A. callidryas sălbatice decât cele aflate în captivitate. Au existat similitudini taxonomice între speciile bacteriene izolate din populațiile sălbatice și captive la nivel de familie și gen. Cu toate acestea, doar o singură specie bacteriană a fost izolată de ambele populații (Stenotrophomonas sp.), Deși trei morfotipuri de la broaștele captive nu au putut fi identificate din cauza datelor de secvență slabe. Interesant este faptul că singura specie comună între broaștele captive și sălbatice a fost izolată doar de broaștele captive hrănite cu o dietă îmbogățită cu carotenoizi, deși cu o abundență relativ scăzută. Având în vedere că atât comunitatea în ansamblu, cât și unele specii bacteriene în special, sunt susceptibile de a fi implicate în protejarea gazdei de agenții patogeni invazivi, acest lucru poate avea implicații asupra capacității broaștelor captive de a se proteja de agenți patogeni, atât în ​​captivitate și asupra reintroducerii în natură și ar putea avea o relevanță deosebită pentru proiectele de conservare pe termen lung care implică conservarea ex situ a amfibienilor.

Concluzii

Acest studiu arată că o dietă îmbogățită cu carotenoizi crește semnificativ bogăția și abundența bacteriilor asociate cu pielea de A. callidryas. Având în vedere rolul bacteriilor cutanate în prevenirea bolilor la amfibieni, dovezile că condițiile din captivitate au potențialul de a afecta în mod semnificativ comunitatea bacteriană pot avea implicații pentru succesul tratamentelor probiotice, precum și influența adecvarea amfibienilor pentru reintroducere. Arătăm, de asemenea, că broaștele captive susțin o comunitate bacteriană divergentă și redusă în comparație cu broaștele sălbatice din aceeași specie. Este necesară mai multă muncă pentru a determina efectele altor afecțiuni captive asupra comunităților bacteriene asociate amfibienilor, precum și modificările microbiotei ca răspuns la transferul din sălbăticie în captivitate, în special în ceea ce privește implicațiile pentru rezistența la boli și succesul probioticului.

Mulțumiri

Autorii ar dori să le mulțumească lui David Springate și John Fitzpatrick pentru asistența lor cu analizele din R. Suntem deosebit de recunoscători lui Paul Johnston și Andres Arce pentru că au oferit sfaturi neprețuite cu privire la planificarea inițială a acestui studiu și lui Christopher Michaels care a oferit comentarii cu privire la proiectele din această lucrare. Lisa Andrejczak a oferit îngrijire zilnică broaștelor.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: REA RLH DJPE VO ALF RFP. Au efectuat experimentele: REA RLH. Analiza datelor: REA RFP. A scris lucrarea: REA.