A. Torres

1 Institutul de cercetare maternă și infantilă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Chile, Casilla 226-3, 8360160 Santiago, Chile

Domnule Iñiguez

1 Institutul de cercetare maternă și infantilă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Chile, Casilla 226-3, 8360160 Santiago, Chile

M. Ferrario

2 Departamentul de Chirurgie, Clínica Las Condes, Santiago, Chile

V. Mericq

1 Institutul de cercetare maternă și infantilă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Chile, Casilla 226-3, 8360160 Santiago, Chile

Abstract

La toți subiecții, înainte de intervenția chirurgicală, a fost prelevată o probă de sânge în repaus alimentar. Informațiile antropometrice (vârsta, greutatea și înălțimea) au fost obținute din datele clinice ale fiecărui subiect.

În timpul procedurii, s-au obținut 5 g de țesut adipos visceral (TVA) și 5 g de țesut adipos subcutanat (SAT). Probele au fost obținute de la Centrul de Chirurgie a Obezității din Clínica Las Condes și Spitalul Clinic San Borja-Arriarán din Santiago, Chile. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Revizuire Instituțională din Clínica Las Condes și toți pacienții au dat consimțământul scris în scris la recrutare.

2.1. Prelucrarea țesutului adipos

În timpul intervenției chirurgicale a fost obținut un eșantion de țesut adipos din compartimentele subcutanate și viscerale. Ambele probe au fost curățate, împărțite imediat și congelate în azot lichid și menținute la –80 ° C pentru extracția totală a ARN-ului și analiza proteinelor.

2.2. Analize biochimice serice

Insulina serică a fost determinată de IRMA (DIAsource, Belgia), cu un coeficient de variație intra și interanaliză (CV) de 2,1 și respectiv 4,5%. Glucoza a fost măsurată prin metoda glucozei oxidazei de la Roche Diagnostics (Mannheim, Germania), cu un CV intra-test și inter-test de 2,5%. Colesterolul total seric, trigliceridele și colesterolul HDL și LDL au fost cuantificate prin sistemul de diagnostic Reflotron (Roche Diagnostics). Trigliceridele au fost măsurate enzimatic folosind o metodă spectrofotometrică. CV-urile intra și interanalize au fost de 1,9 și respectiv 3,7%. Sensibilitatea la insulină (IS) a fost estimată din insulina de post (I0) și nivelurile de glucoză utilizând modelul homeostaziei (HOMA-IR) [13].

2.3. Testele de expresie

2.3.1. Izolarea și cuantificarea ARN-ului total

ARN-ul total a fost extras din aproximativ 100 mg de TVA și SAT folosind reactiv TRIzol (Invitrogen Corp., CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Bucățile de țesut adipos au fost omogenizate în 1 ml de TRIzol suplimentat cu glicogen (0,25 mg/ml, Amersham Life Sciences) folosind un omogenizator mecanic (Kontes Glass Company, Vineland, NJ, SUA) fazele au fost separate prin centrifugare (12000 rpm timp de 20 min la 4 ° C) după adăugarea de cloroform. Pentru precipitarea ARN, izopropanolul a fost adăugat la supernatant și centrifugat la 12000 rpm cu 15 minute la 4 ° C. Peleta a fost spălată în 500 pl etanol 75%. ARN a fost resuspendat în apă tratată cu dietilpirocarbonat. Integritatea ARN a fost evaluată prin electroforeză pe geluri de agaroză 2% (greutate/volum), iar cantitatea a fost determinată spectrofotometric într-un NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, SUA). ADN-ul complementar a fost sintetizat din 2 μg de ARN total digerat anterior de DNAse I (Fermentas, SUA) folosind primerii aleatori (Invitrogen) și 200 U revers transcriptază RevertAid H Minus M-MuLV (Fermentas), urmând instrucțiunile producătorului.

2 μL ADNc a fost utilizat pentru amplificarea 11β-HSD1 ajustat la un volum total de 25 μL prin adăugarea de tampon PCR conținând 3 mmol/LMgCl2, 0,63 U Taq ADN polimerază (Invitrogen), un amestec de nucleotide și 0,4 μmol/L din fiecare din două grunduri specifice (în amonte: 5 ′ ′ - AGGAAAGCTCATGGGAGGACTAG-3 ′ ′ și în aval: 5 ′ ′ - ATGGTGAATATCATCATGAAAAAGATTC-3 ′ ′). Reacția a fost efectuată în Thermocycler PT-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA, SUA) folosind condiții care au fost anterior standardizate: denaturarea la 94 ° C timp de 1 min; recoacere la 55 ° C timp de 1 min; extindere la 72 ° C timp de 1 min 30 seg și repetarea acestora timp de 31 de cicluri.

Ca control intern, ADNc 18S rARN a fost amplificat în fiecare probă în aceleași condiții descrise mai sus, cu excepția 1,5 mmol/L MgCl2 și repetat timp de 18 cicluri. Pentru a determina că amplificarea tuturor genelor se încadra într-un interval liniar, am evaluat liniaritatea amplificării transcrierilor corespunzătoare în țesutul adipos și ulterior am selectat numărul de cicluri. Ampliconii de (139 pb, pentru 11β-HSD1 și 191 pb pentru 18S rARN) au fost vizualizați pe gel de agaroză 2% folosind GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium). Semi-cuantificarea produselor PCR a fost realizată prin analiza imaginii (KODAK EDAS 290 Sistem de documentare și analiză a electroforezei, software Kodak 1D Image Analysis). Rezultatele sunt exprimate ca raportul dintre gena studiată de ARNm/ARNr 18S (AU = unități arbitrare).

2.4. Analize enzimatice

Extragerea proteinelor -

Țesuturile TVA și SAT au fost omogenizate în PBS 0,1 M răcit cu gheață pH 7,5 suplimentat cu antiproteaze (tablete complete, mini, fără EDTA, inhibitoare de protează, cocktail-uri, Roche Applied Science). Omogenatul tisular a fost apoi centrifugat la 12000 rpm timp de 30 min la 4 ° C și supernatantul rezultat a fost colectat și testat pentru concentrația de proteine ​​folosind kitul de testare a proteinei BCA (Pierce, Rockford, IL, SUA) cu BSA ca standard.

2.4.1. Activitatea enzimatică a 11β-HSD1

Testul enzimatic a fost descris anterior de Mericq și colab. [14], modificat pentru a se potrivi tipului de țesut în studiu. Condițiile de reacție au fost stabilite folosind diferite concentrații de cofactor, cortizon neetichetat și timpul de incubație. De asemenea, a fost evaluată linearitatea reacției enzimatice.

Pe scurt, 200 μg de extract proteic au fost incubate în 0,5 ml tampon fosfat (0,1 mol/L pH 7,6) în prezența a 25000 c.p.m. de [3] -cortizon (Amersham, Marea Britanie), 0,05 μM cortizon și 400 μM NADPH (Sigma Chemicals). Reacția a fost inițiată cu adăugarea cofactorului timp de 24 de ore la 37 ° C într-o baie de apă agitată. Alicote au fost extrase în 7 volume de diclormetan și steroizii au fost separați prin cromatografie în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC, Merck), folosind metanol-cloroform (8: 92) ca fază mobilă. Benzile care conțin cortizonul și cortizolul marcate au fost identificate prin lumina UV a purtătorilor reci, tăiate și numărate într-un contor de scintilație (Tracor Analytic Delta 300). Ratele de cortizon la cortizon au fost calculate din activitatea specifică a cortizolului marcat și radioactivitatea cortizolului (picograme) formate pe mg de proteină pe oră.

2.4.2. Analiza Western Blot

Cantități egale (12,5 μg) de proteine ​​adipoase au fost rezolvate prin electroforeză utilizând geluri SDS-poliacrilamidă 14% și apoi transferate în membrane de nitroceluloză (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA). Membranele au fost blocate cu 5% BSA în TBS-T (20 mmol/L Tris pH 7,2, 137 mmol/L NaCI, 0,1% (v/v) Tween-20) timp de 1 oră la temperatura camerei. Bloturile au fost testate cu anticorpi împotriva 11β-HSD1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) și a β-actinei (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). După o spălare extinsă, benzile au fost detectate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (Rockland Immunochemical Research, Gilbertsville, PA, SUA), urmată de chemiluminescență îmbunătățită (ECL plus Western Blotting Detection System; Amersham Biosciences, Little Chalfont, Marea Britanie). Imaginile au fost achiziționate și evaluate utilizând software-ul UltraQuant pentru achiziționarea și analiza imaginilor (Ultralum Inc., Claremont, CA, SUA), normalizate în raport cu β-actina și exprimate ca unități arbitrare (AU).

2.4.3. Analize statistice

Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM. Conform distribuției datelor între un test t sau un test Mann-Whitney a fost utilizat pentru a compara grupurile și testul t asociat sau testul Wilcoxon pentru comparații intragrup. Studiile de corelații au fost efectuate folosind testul Pearson sau Spearman în funcție de distribuția datelor. Statisticile au fost realizate folosind SPSS v11.5.

3. Rezultate

3.1. Expresia țesutului adipos al 11β-HSD1

Nu s-au găsit diferențe în expresia genică a enzimei 11β-HSD1 în TVA și SAT la subiecții obezi și la subiecții nonobezi. În plus, nu s-au găsit diferențe în expresia genei TVA a enzimei 11β-HSD1 nici între grupul obez și nonobez, nici în SAT față de obez comparativ cu omologii lor.

diferențe

RT-PCR de 11β-HSD1. Nivelurile de ARNm în țesutul adipos visceral (TVA) și țesutul adipos subcutanat (SAT) separate prin sex. (a) Femei, (b) bărbați. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM.

3.2. Nivelurile de proteine ​​ale țesutului adipos de 11β-HSD1

O imagine reprezentativă a analizei Western blot în țesutul adipos, utilizând un anticorp specific, este prezentată în Figura 2 pentru 11β-HSD1 cu o greutate moleculară de 34 kDa (banda așteptată) și două benzi suplimentare de 50 și 68 kDa.

Nivelurile și activitatea proteinelor de 11β-HSD1. Nivelurile de proteine ​​și activitatea enzimatică în țesutul adipos visceral (TVA) și țesutul adipos subcutanat (SAT) separate prin sex. (a, c) Femeile, (b, d), respectiv, bărbații. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. K: rinichi F: fibroblast cutanat uman.

Conținutul de proteine ​​din izoforma de 34 kDa a 11β-HSD1 din TVA nu a fost diferit la subiecții obezi și non-obezi (0,35 ± 0,08 față de 0,41 ± 0,17 UA resp., P = ns), precum și în SAT (0,14 ± 0,04 față de 0,06 ± 0,05). Banda suplimentară de 50 kDa a fost descrisă anterior în țesutul adipos uman ca o izoformă a 11β-HSD1 [15, 16]. În studiul nostru, această formă de 50 kDa a fost mai abundentă decât izoforma de 34 kDa. Această bandă a fost observată și la fibroblastele pielii umane și la rinichi (Figura 2).

O bandă suplimentară de 68 kDa corespunzătoare formei dimerice a 11β-HSD1, descrisă anterior în acest țesut [15, 16], în TVA și SAT nu a diferit, între bărbați sau femei obezi și nonobezi (datele nu sunt prezentate).

3.3. Activitatea țesutului adipos al 11β-HSD1

Activitatea enzimei 11β-HSD1 în TVA la obezi a fost mai mică decât activitatea enzimei la subiecții nonobezi (datele nu sunt prezentate). Nu s-au găsit diferențe în activitatea enzimatică în SAT a obezilor comparativ cu subiecții nonobezi.

Combinând toți subiecții (obezi și nonobezi), am găsit o corelație negativă semnificativă între activitatea enzimei 11β-HSD1 și IMC (SDS) (r = - 0,290; P = 0,046) (datele nu sunt prezentate). Apoi am separat eșantionul în funcție de sex și am constatat că corelația semnificativă a avut loc doar la femei (r = - 0,418; P = 0,042; Figura 4). În mod similar, s-a găsit o corelație inversă între conținutul de proteine ​​enzimatice din TVA și IMC (SDS) la femei, dar nu și la bărbați (r = - 0,513; P = 0,012; Figura 3). Aceste corelații nu au fost observate în SAT.

Relația dintre nivelurile de proteine ​​de 11β-HSD1 în țesutul adipos visceral și indicele de masă corporală (SDS) în întregul grup separat de sex.

Relația dintre activitatea enzimatică a 11β-HSD1 în țesutul adipos visceral și indicele de masă corporală (SDS) în întregul grup separat de sex.

Am analizat, de asemenea, dacă a existat vreo diferență de expresie sau activitate a enzimei 11β-HSD1 între subiecții obezi (M + W) cu cel mai prost profil metabolic folosind HOMA-IR și terțile trigliceridelor. Comparând terțilele mai mari cu cele inferioare ale acestor parametri, nu am găsit diferențe la subiecții obezi (datele nu sunt prezentate).

4. Discutie

În studiul de față, am analizat posibilele modificări ale expresiei genei, activității și conținutului de proteine ​​ale 11 β-hidroxisteroid dehidrogenazei tip 1, implicate în metabolismul cortizolului, în țesutul adipos subcutanat (SAT) și visceral (TVA) al adulților obezi de ambele sexe supuse unei intervenții chirurgicale bariatrice. În plus, am comparat rezultatele cu cele obținute la o populație adultă neobeză. De asemenea, am determinat concentrațiile de glucoză serică, insulină, colesterol total și trigliceride atât în ​​grupurile obeze, cât și în cele nonobeze.

În prezenta investigație, am selectat un grup omogen de gen de subiecți obezi și, așa cum era de așteptat, s-au observat diferențe semnificative în greutate și IMC atât pentru bărbați, cât și pentru femei, în comparație cu controalele respective.

Expresia genică a 11β-HSD1 nu a arătat diferențe la compararea grupului obez cu grupul nonobez, în concordanță cu cea raportată de Cooper și Stewart [17]. Mariniello și colab., Cu toate acestea, au găsit o expresie mai mare a 11β-HSD1 în TVA la obezi în comparație cu martorii, probabil din cauza unei dimensiuni mai mici a eșantionului [15]. Autorii propun că IMC poate fi un factor care ar putea influența rezultatele. IMC mediu din raportul lui Mariniello și colab. [15] a fost de 44 kg/m 2 și în raportul lui Cooper și Stewart [17] a fost de 33 kg/m 2, acesta din urmă fiind mai aproape de grupul nostru de studiu (35 kg/m 2), unde s-au găsit rezultate similare. Deși expresia genică a 11β-HSD1 nu a diferit atunci când se compară obezitatea și martorii, am găsit o expresie mai mică a 11β-HSD1 în TVA la femei.

Pentru a face un pas mai departe în găsirea cauzelor modificării metabolismului cortizolului în țesutul adipos, am procedat apoi la determinarea conținutului de proteine ​​și a activității enzimatice a 11β-HSD1 în acest țesut. Conform rezultatelor obținute în prezentul studiu și a celor raportate de Kannisto și Mariniello, forma moleculară de 34 kDa a 11β-HSD1 aparent nu joacă un rol important în țesutul adipos, determinându-ne să ne concentrăm asupra formei de 50 kDa. Prezența acestei forme a fost caracteristică acestui tip de țesut și a avut o abundență relativă mai mare comparativ cu izoforma de 34 kDa. La subiecții obezi, am găsit un conținut mai scăzut de proteine ​​în forma de 50 kDa în TVA la obezi comparativ cu femeile neobeze, care nu a fost observat nici în SAT de la femei, nici în TVA sau SAT de bărbați, iar aceste niveluri de proteine ​​au fost asociate negativ cu IMC numai la femei. Deși dovezile rămân necunoscute cu privire la activitatea biologică a acestei forme, această lucrare a stabilit un precedent pentru studii ulterioare ale acestei forme de 50 KDa.

În ceea ce privește activitatea enzimatică a 11β-HSD1, rezultatele au fost similare cu cele găsite cu conținutul de proteine. Activitatea enzimei 11β-HSD1 în funcție de sex a fost redusă la obezi în TVA comparativ cu femeile non-obeze. Aceste rezultate nu au fost găsite la bărbați. Această activitate redusă de 11β-HSD1 în TVA găsită la femei a fost asociată negativ cu IMC, ceea ce nu a fost observat nici la bărbați, sugerând că metabolismul cortizolului prin enzima 11β-HSD1 este reglementat în TVA cu dimorfism sexual.

Există puține rapoarte care au măsurat activitatea enzimatică a 11β-HSD1 în țesutul adipos. Deși s-a constatat că atât activitatea, cât și expresia enzimei în SAT mențin, în general, o asociere pozitivă cu IMC [17, 18], rezultatele TVA sunt controversate. Într-un caz, nu a existat nicio diferență de activitate între subiecții obezi și slabi, sugerând un posibil efect al concentrației cofactorului NADPH în modularea activității enzimatice [19], în timp ce într-un alt studiu o relație directă între activitatea viscerală 11β-HSD1 și IMC iar masa viscerală a grăsimii a fost raportată [20]. A fost propusă o posibilă contribuție a macrofagelor la modularea activității enzimatice, deși într-o măsură mai mică [21].

La șoareci, rapoartele disponibile arată o asociere clară între efectul distribuției anatomice a țesutului adipos și dezvoltarea caracteristicilor tipice ale sindromului metabolic, în care țesutul adipos visceral joacă un rol cheie în comparație cu SAT. Cu toate acestea, rezultatele în ceea ce privește expresia genică și activitatea enzimatică a 11β-HSD1 în studii pe țesut adipos visceral și subcutanat la om au fost controversate și nu au confirmat observațiile la modelele murine. În timp ce unele studii au găsit diferențe în expresia și/sau activitatea enzimei 11β-HSD1 în TVA la obezi comparativ cu martorii [15] sau între TVA și SAT la subiecții obezi [11, 22], alții nu au găsit diferențe între obezi și femeile neobeze [11].

Rezultatele noastre sugerează existența unui posibil mecanism modulator al activității enzimatice a 11β-HSD1 în țesutul adipos al femeilor care este diferit de bărbați.

Această scădere a activității enzimatice este produsul expresiei mai scăzute și al conținutului de proteine ​​de 11β-HSD1 în TVA la femei. Aceste descoperiri ar putea duce la o scădere a concentrațiilor portalului de cortizol care protejează organismul de efectul dăunător al obezității viscerale. Cu toate acestea, cantitatea totală de masă grasă a indivizilor obezi este probabil suficient de mare încât acest efect compensator poate fi atenuat. Aceste constatări trebuie confirmate în studii viitoare, inclusiv un număr mai mare de subiecți. Recent, contribuția cortizolului hepatic și adipos derivat în reglarea axei HPA-suprarenale a fost explorată într-un model de șoareci transgenici cu o deleție specifică ficatului de 11β-HSD1 [23]. Autorii au arătat că acești șoareci au reușit să regenereze cortizolul de la cortizon la 40% din control și corticosteronul circulant a fost nealterat, dar dimensiunea suprarenală a crescut, indicativ pentru stimularea cronică a HPA. Ei concluzionează că deleția specifică ficatului de 11β-HSD1 reduce regenerarea corticosteronului și poate fi importantă pentru stabilirea aspectelor tonusului axei HPA, fără a afecta profilul metabolitului steroidului urinar, subliniind contribuția diafragmei dintre țesuturile țintă glucocorticoizi în determinarea fenotipului metabolic.

În rezumat, raportăm o expresie și o activitate enzimatică mai scăzute de 11β-HSD1 în TVA la obezi comparativ cu femeile nonobeze, ceea ce ar duce la o producție locală redusă de cortizol.

Conflict de interese

Nu există niciun conflict de interese care să poată fi perceput ca prejudiciază imparțialitatea cercetării.