Hiroshi Shimoda

1 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd., Divizia de cercetare și dezvoltare, 1 Numata Kitagata-cho, Ichinomiya, Aichi 493-8001, Japonia

Amy Seki

1 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd., Divizia de cercetare și dezvoltare, 1 Numata Kitagata-cho, Ichinomiya, Aichi 493-8001, Japonia

Michio Aitani

1 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd., Divizia de cercetare și dezvoltare, 1 Numata Kitagata-cho, Ichinomiya, Aichi 493-8001, Japonia

Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit în conformitate cu condițiile Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea nelimitată în orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citat corespunzător.

Abstract

fundal

Un studiu epidemiologic efectuat în Italia a indicat că cafeaua are cea mai mare capacitate antioxidantă dintre băuturile consumate în mod obișnuit. Boabele de cafea verde sunt bogate în acid clorogenic și în compușii săi înrudiți. Efectul extractului de boabe de cafea verde (GCBE) asupra acumulării de grăsime și a greutății corporale la șoareci a fost evaluat cu obiectivul de a investiga efectul GCBE asupra obezității ușoare.

Metode

Șoarecii bărbați ddy au fost hrăniți cu o dietă standard care conțin GCBE și constituenții săi principali, și anume, cofeină și acid clorogenic, timp de 14 zile. Mai mult, nivelul trigliceridelor hepatice (TG) a fost, de asemenea, investigat după administrarea consecutivă (13 zile) a GCBE și a constituenților săi. Pentru a examina efectul GCBE și al constituenților săi asupra absorbției grăsimilor, modificările serice ale TG au fost evaluate la șoarecii încărcați cu ulei de măsline. În plus, pentru a investiga efectul asupra metabolismului TG hepatic, activitatea carnitinei palmitoiltransferazei (CPT) la șoareci a fost evaluată după ingestia consecutivă (6 zile) de GCBE și constituenții săi (cafeină, acid clorogenic, acid neoclorogenic și amestec de acid feruloilquinic).

Rezultate

S-a constatat că 0,5% și 1% GCBE au redus conținutul de grăsime viscerală și greutatea corporală. Cofeina și acidul clorogenic au arătat tendința de a reduce grăsimea viscerală și greutatea corporală. Administrarea orală de GCBE (100 și 200 mg/kg · zi) timp de 13 zile a arătat o tendință de reducere a TG hepatic la șoareci. În același model, acidul clorogenic (60 mg/kg · zi) a redus nivelul TG hepatic. La șoarecii încărcați cu ulei de măsline (5 ml/kg), GCBE (200 și 400 mg/kg) și cofeină (20 și 40 mg/kg) au redus nivelul seric al TG. GCBE (1%), acid neoclorogenic (0,028% și 0,055%) și amestec de acid feruloilchinic (0,081%) au îmbunătățit semnificativ activitatea CPT hepatică la șoareci. Cu toate acestea, nici cofeina, nici acidul clorogenic nu s-au dovedit a crește activitatea CPT.

Concluzie

Aceste rezultate sugerează că GCBE este posibil eficient împotriva creșterii în greutate și a acumulării de grăsime prin inhibarea absorbției grăsimilor și activarea metabolismului grăsimilor în ficat. S-a constatat că cofeina este un supresor al absorbției grăsimilor, în timp ce acidul clorogenic a fost parțial implicat în efectul supresiv al GCBE care a dus la reducerea nivelului de TG hepatic. Compușii fenolici, cum ar fi acidul neoclorogenic și amestecul de acid feruloilquinic, cu excepția acidului clorogenic, pot spori activitatea CPT hepatică.

fundal

Metode

Animale

Șoareci de sex masculin ddy (Japan SLC Inc., Shizuoka, Japonia) au fost folosiți pentru experimente. Animalele au fost adăpostite la 23 ° C ± 1 ° C și au fost hrănite cu dietă standard nepurificată (CE-2, Clea Japan Inc., Shizuoka, Japonia) și apă de la robinet ad libitum. Experimentele au fost efectuate în conformitate cu Ghidurile pentru experimentarea animalelor (Asociația Japoneză pentru Știința Animalelor de Laborator, 1987). Toate proiectele experimentale au fost aprobate de Comitetul etic pentru utilizarea animalelor experimentale.

Pregătirea și determinarea GCBE

GCBE (randament: 13,7%) a fost extras din boabe de cafea verde (coffea canephora) la 70 ° C timp de 2 ore folosind etanol 70%. Cofeina, acidul clorogenic și compușii săi înrudiți au fost analizați prin HPLC folosind cafeină anhidră (Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japonia) și acid clorogenic (Sigma-Aldrich Co., Ltd., St. Louis, MO, SUA) ca standarde (Figura (Figura 1). 1). HPLC echipat cu un Capcellpack C18 (4,6 × 250 mm, Shiseido, Tokyo, Japonia) și un detector de matrice de fotodiodă (SPD-10 Avp, Shimadzu, Kyoto, Japonia) a fost utilizat. Solventul utilizat a inclus (A) 2 mM H3PO4 și (B) CH3CN; un gradient liniar de (A) a fost schimbat în (B) după 35 de minute. Debitul a fost menținut la 1,0 ml/min. Cantitățile de cafeină și acid clorogenic detectate au fost de 10,0% și 27,0%. Așa cum se arată în Figura 2, 2, GCBE conține acid clorogenic și alți compuși înrudiți, și anume, acid 3-cafeoilchinic (acid neochlorogenic) și un amestec de acizi feruloilchinici. Acești compuși au fost izolați și identificați din GCBE [14]. Cantitățile de acid 3-cafeoilchinic și un amestec de acizi feruloilchinici folosind acid clorogenic standard au fost de 5,5% și 16,0%. Conținutul de acid 4,5-dicaffeoilchinic a fost de 5,2% folosind o probă autentică care a fost izolată din butterbur japonez.

boabe

Cromatogramă HPLC tridimensională a GCBE.

Structurile chimice ale constituenților GCBE.

Reactivi

Sesamin (Industrial Research, Ltd., Wellington, Noua Zeelandă) și orlistat (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Elveția) au fost folosite ca compuși de referință. EDTA a fost achiziționată de la Kishida Chemical Co., Ltd. (Osaka, Japonia), în timp ce palmitoil CoA și L-carnitină au fost obținute de la Sigma-Aldrich Co., Ltd. (MA, SUA). Soluție salină tamponată cu fosfat fără calciu și magneziu [PBS (-)], E-test triglicerid Wako, ulei de măsline, zaharoză, Triton X-100 și 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoat) (DTNB) au fost achiziționate de la Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia.

Măsurători ale greutății corpului șoarecilor și ale grăsimilor viscerale

Șoarecilor în vârstă de șase săptămâni li s-a oferit acces gratuit la dieta nepurificată (CE-2) conținând 0,5% sau 1% GCBE timp de 14 zile. La dietă s-au adăugat cafeină (0,05% și 0,1%) și acid clorogenic (0,15% și 0,3%). Șoarecii au fost cântăriți la fiecare 2 zile. Șoarecii grăsimi epididimale și perirenale au fost îndepărtate și cântărite la sfârșitul experimentului. Orlistat, un medicament prescris pentru obezitate, a fost folosit ca un control pozitiv.

Măsurători ale nivelului de trigliceride hepatice la șoareci

Suspensia de gumă de salcâm (5%) conținând GCBE (100 și 200 mg/kg · zi), cofeină (10 și 20 mg/kg · zi) și acid clorogenic (30 și 60 mg/kg · zi) a fost administrată zilnic până la 5 săptămâni -soareci vechi timp de 13 zile. În ziua 14, ficatul a fost îndepărtat și aproximativ 200 mg de ficat au fost omogenizați în 1 ml de PBS (-). Această suspensie a fost apoi centrifugată (2200 × g, 10 min), urmată de extracția trigliceridelor hepatice (TG) folosind un amestec de cloroform și metanol (2: 1). Extractul a fost evaporat și resuspendat în 1 ml PBS (-). Conținutul TG a fost măsurat utilizând testul E-test cu trigliceride Wako. Sesamin a fost folosit ca un control pozitiv.

Determinarea TG seric la șoareci încărcați cu ulei de măsline

Experimentele au fost efectuate așa cum a fost descris de Shimoda și colab. [15]. Probele inițiale de sânge au fost colectate din plexul venos infraorbital al șoarecilor (cu vârsta cuprinsă între 5 și 6 săptămâni) după post timp de 20-22 ore. Șoarecii au fost administrați cu o suspensie de gumă de salcâm (5%) conținând GCBE (200 și 400 mg/kg), cofeină (20 și 40 mg/kg) și acid clorogenic (60 și 120 mg/kg). După 30 de minute, ulei de măsline (5 ml/kg) a fost administrat șoarecilor. Probele de sânge au fost colectate la intervale de 2 ore după încărcarea cu ulei de măsline. Probele au fost centrifugate și TG seric a fost măsurat folosind testul E-test cu trigliceride Wako. Orlistat a fost folosit ca un control pozitiv.

Măsurători ale activității hepatice a carnitinei palmitoiltransferazei la șoareci

Șoarecii în vârstă de șase săptămâni au fost hrăniți cu o dietă (CE-2) conținând GCBE (0,5% și 1%), cofeină (0,05% și 0,1%), acid clorogenic (0,15% și 0,3%), acid neoclorogenic (0,028% și 0,055 %) și un amestec de acizi feruloilchinici (0,081%) timp de 6 zile. Ficăcii de șoareci au fost îndepărtați și omogenizați în tampon Tris-HCI (pH 7,4) cântărind de 6 ori mai mult decât greutatea ficatului conținând 0,25 M zaharoză și 1 mM EDTA. Omogenatul a fost centrifugat (880 × g, 4 ° C, 10 min) și supernatantul a fost colectat; aceasta a fost urmată de o a doua centrifugare (11.770 × g, 4 ° C) pentru a obține fracția mitocondrială. Precipitatul fracției mitocondriale a fost spălat și suspendat în tampon pentru a obține o concentrație de proteine ​​de 6 mg/ml. Activitatea CPT a fost măsurată conform metodei descrise de Markwell și colab. [16]. Tampon Tris (58 mM, pH 8,0, 1 mL) conținând 1,25 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 și 0,25 mM DTNB, 37,5 μM palmitoil CoA (20 μL) și 6 mg/ml fracție mitocondrială (20 μL) au fost amestecate, iar densitatea optică (DO) a fost înregistrată la 412 nm timp de 5 min. Ulterior, s-a adăugat 1,25 mM L-carnitină (20 μL) și OD a fost înregistrat timp de 5 min. Activitatea CPT a fost calculată după cum urmează:

ΔOD a: Liniaritatea modificării densității optice timp de 1 min după adăugarea soluției de L-carnitină

ΔOD b: Liniaritatea modificării densității optice timp de 1 min la momentul inițial

c: Volumul fracției mitocondriale (μL)

d: Coeficientul de extincție molară al palmitoil-CoA

e: Conținutul de proteine ​​în fracțiunea mitocondrială (mg proteină/ml)

Statistici

Rezultatele au fost exprimate ca medie ± SE. Semnificația diferențelor a fost examinată folosind metoda ANOVA unidirecțională, urmată de testul lui Dunnett. Rezultate cu p Tabelul 1. 1. Cantitatea de aport alimentar nu a fost redusă în timpul tratamentului cu GCBE. GCBE (0,5% și 1%) a suprimat în mod semnificativ greutatea corporală a șoarecilor. Greutatea grăsimilor epididimale și perirenale de șoareci a fost semnificativ redusă în grupul tratat cu GCBE (0,5%). Cu toate acestea, rezultatele pentru efectul cofeinei (0,05% și 0,1%) asupra suprimării greutății corporale și a grăsimii viscerale nu au fost semnificative. Acidul clorogenic (0,15% și 0,3%) a demonstrat un efect supresiv slab asupra greutății corporale și a acumulării de grăsime perirenală. Orlistat (0,1%), controlul pozitiv, a arătat un ușor efect supresiv asupra acumulării de grăsimi epididimale și perirenale, dar niciun efect supresiv asupra greutății corporale.

tabelul 1

Efectele GCBE și ale componentelor sale asupra creșterii în greutate corporală și a acumulării de grăsimi viscerale

Conținut în dietă (%)Consumul total mediu de alimente (g/corp)Greutatea corporală inițială Ziua 0 (g)Greutatea corporală finală Ziua 14 (g)
Control--75.328,2 ± 0,637,5 ± 1,6
GCBE0,580.027,3 ± 0,533,2 ± 0,6 *
175,526,9 ± 0,732,8 ± 1,2 **
Cofeină0,0574.927,0 ± 0,435,0 ± 1,0
0,174.326,6 ± 0,433,9 ± 0,7
Acid clorogenic0,1581.327,3 ± 0,535,2 ± 0,5
0,376,526,4 ± 0,334,5 ± 0,5
Control--73,826,8 ± 0,434,6 ± 1,2
Orlistat0,0582,427,0 ± 0,235,0 ± 0,4
0,181.326,3 ± 0,234,2 ± 1,0
Conținut în dietă (%)Creșterea în greutate corporală (g)Grăsimi epididimale (mg)Grăsime perirenală (mg)
Control--9,3 ± 0,4605 ± 71223 ± 39
GCBE0,56,0 ± 0,1 *393 ± 59 *106 ± 20 *
15,8 ± 0,2 *448 ± 68124 ± 23
Cofeină0,058,0 ± 0,2536 ± 57146 ± 29
0,17,3 ± 0,2491 ± 39150 ± 20
Acid clorogenic0,157,9 ± 0,1574 ± 48173 ± 24
0,38,1 ± 0,1605 ± 82175 ± 25
Control--7,8 ± 0,9588 ± 55249 ± 60
Orlistat0,058,1 ± 0,4612 ± 56251 ± 45
0,17,8 ± 0,9481 ± 51 *180 ± 33 *

Șoarecii au fost hrăniți cu dietă nepurificată (CE-2) conținând fiecare probă timp de 14 zile. Fiecare valoare reprezintă media ± SE a 6-7 șoareci. Asteriscurile denotă diferențe semnificative față de grupul martor, *: p Figura 3 3 ilustrează efectul GCBE, cofeinei și acidului clorogenic asupra TG hepatică. GCBE și cofeina au arătat o tendință de a suprima TG hepatic. Mai mult, nivelul TG hepatic a fost semnificativ redus de acidul clorogenic (60 mg/kg · zi), sugerând rolul său în suprimarea TG hepatic în grupul tratat cu GCBE.

Efectele GCBE, cofeinei, acidului clorogenic și ale sesaminei asupra acumulării hepatice de TG la șoareci. Fiecare probă a fost administrată o dată pe zi timp de 13 zile. Coloanele reprezintă media ± SE a 7 șoareci. Asteriscurile duble denotă o diferență semnificativă față de grupul de control, **: p Figura 4. 4. În mod similar, cofeina (20 și 40 mg/kg) a arătat, de asemenea, un efect supresiv asupra creșterii nivelurilor serice de TG. Cu toate acestea, acidul clorogenic la concentrații de 60 și 120 mg/kg nu a afectat nivelurile serice de TG. Se sugerează că cafeina este compusul care contribuie la suprimarea absorbției grăsimilor la șoarecii tratați cu GCBE. Nivelul crescut de TG seric a fost complet suprimat de orlistat (60 mg/kg).