Lauren Votava

1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110

3 Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

Andrea G. Schwartz

1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110

Natalia S. Harasymowicz

1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110

Chia-Lung Wu

1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110

Farshid Guilak

1 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

2 spitale Shriners pentru copii - St. Louis, St. Louis MO 63110

3 Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, MO 63110

Contribuțiile autorului: LV și FG au dezvoltat conceptul și au conceput experimente. LV a efectuat experimente. LV, AGS, NSH și CLW au analizat datele. LV a scris manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final trimis.

Abstract

INTRODUCERE

Pentru a studia mai direct mecanismele care leagă obezitatea și OA, au fost dezvoltate modele animale de obezitate folosind fie o dietă bogată în grăsimi 10-14, fie ablația genetică a semnalizării leptinei (de exemplu, șoareci ob/ob sau db/db). 15 Studii multiple au arătat o severitate crescută a OA spontană 15-17 sau OA indusă de leziuni 7,13,14 la animale hrănite cu o dietă bogată în grăsimi, dar lipsa OA spontană la șoarecii obezi cu deficit de leptină hrăniți cu o dietă standard chow . 15

Există, de asemenea, dovezi în creștere că compoziția dietetică în sine poate contribui la OA indusă de obezitate. În plus față de conținutul caloric, există dovezi din ce în ce mai mari că compoziția dietei, în special conținutul de acizi grași, poate avea efecte semnificative asupra severității OA într-o manieră specifică articulațiilor. 7,10,18,19 De exemplu, dietele bogate în grăsimi compuse în principal din acizi grași saturați (SFA) sau acizi grași polinesaturați ω-6 (PUFA) prezintă OA la genunchi indus de leziuni considerabil mai slabe decât omologii cu greutate ridicată dietă grasă cu FA-3 PUFA sau o dietă standard pentru șoareci. 10 Aceste studii au observat că o dietă bogată în grăsimi suplimentată în FA-3 PUFA protejează genunchiul de OA indusă de leziuni, în timp ce dietele bogate în grăsimi bogate în grăsimi saturate și ω-6 PUFA exacerbează degenerarea cartilajului și sinovita după leziuni la genunchi. Cu toate acestea, nu s-a observat nici un efect semnificativ al creșterii PUFA ω-3 dietetice asupra dezvoltării OA spontană în articulația genunchiului. 7,10,20

Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă conținutul de acizi grași din dietă a influențat apariția modificărilor structurale spontane ale OA și ale oaselor la șoarecii obezi cu conținut ridicat de grăsimi. Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă chow de control cu ​​conținut scăzut de grăsimi, fie cu diete bogate în grăsimi bogate în FA-3 PUFA, ω-6 PUFA sau SFA. Am emis ipoteza că dieta bogată în FA-3 PUFA ar avea un efect protector asupra cartilajului și a oaselor. Osul, cartilajul și sinoviul capetelor humerale au fost analizate pentru modificări asociate OA folosind tomografia micro-computerizată (MicroCT) pentru a examina microstructura osoasă, microscopia cu forță atomică (AFM) pentru a examina proprietățile mecanice ale cartilajului la scară mică și clasificarea histologică la evaluați degenerarea cartilajului și inflamația sinovială.

METODE

Model animal.

Începând cu vârsta de 4 săptămâni, șoarecii masculi C57BL/6J au fost hrăniți timp de 24 de săptămâni fie cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (10% kcal), fie una dintre cele trei diete bogate în grăsimi (60% kcal) bogate în FA-3 PUFA, ω-6 PUFA sau SFA . Acești șoareci au fost inițial dezvoltați pentru un studiu anterior care investiga modul în care acizii grași din dietă afectează dezvoltarea OA a genunchiului și au fost raportate date privind conținutul dietetic, greutățile corporale, severitatea OA a genunchiului, măsurarea citokinelor și lipidelor serice și răspunsul la vindecarea rănilor urechii. 7.10 Astfel, nu au fost utilizate animale vii în prezentul studiu, dar toate procedurile anterioare de utilizare a animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor. 7.10 Toate eșantioanele au fost depozitate la -20˚C după eutanasie. Înainte de analiză, exemplarele au fost decongelate la 4 ° C, iar capetele humerale au fost izolate.

Analiza MicroCT a osului trabecular și cortical.

Capetele humerale au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore la temperatura camerei (n = 12-15 per grup de dietă). Eșantioanele au fost apoi deshidratate în etanol și scanate în aer cu MicroCT (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, MA) la o rezoluție de 9 μm/pixel, o tensiune de raze X de 55 kV, curent 455 μA, timp de expunere 980 ms, 3x cadru mediu, și filtrarea fasciculului cu filtru de aluminiu de 0,5 mm. Densitatea minerală osoasă a fost calibrată utilizând fantome de hidroxiapatită (Bruker). Regiunile trabeculare ale capului humeral au fost definite ca volumul dintre placa osoasă subcondrală și placa proximală de creștere. Fiecare regiune a fost analizată folosind extensia BoneJ în ImageJ. S-au calculat fracțiunea volumului osului trabecular (BV/TV), grosimea trabeculară (Tb.Th.) și separarea trabeculară (Tb.Sp.). Regiunile osoase corticale au fost analizate folosind pachetul software CTan automat (Bruker). Aria și grosimea secțiunii transversale a osului cortical au fost calculate din 20 de felii situate la două regiuni diafizare: 0,5 mm de aspectul distal al capului humeral și la aspectul distal al tuberozității deltoide (n = 6-14).

Microscopia forței atomice.

Testarea mecanică a proprietăților microscale ale cartilajului a fost efectuată cu un AFM așa cum sa descris anterior. 28.30 Pe scurt, capetele humerale proaspăt disecate au fost încorporate într-un mediu de temperatură optimă de tăiere (OCT) și s-au obținut criosecții groase de 5 μm ale cartilajului articular al capului humeral. Secțiunile au fost scurt decongelate și colorate imunologic pentru colagen VI ca marker al PCM. Pe scurt, secțiunile au fost spălate în PBS, blocate în ser de capră normal 10% și incubate cu anticorpi de colagen policlonal tip VI de afinitate purificat (Fitzgerald Industries, Acton, MA) diluate 1: 200 în soluție de blocare timp de 1 oră. Secțiunile au fost clătite cu PBS și colorate cu AlexaFluor 488 anticorp conjugat de capră anti-iepure diluat la 1: 200 în soluție de blocare (Abcam, Cambridge, MA). Secțiunile au fost menținute în PBS până la analiză pentru a păstra hidratarea. Modulul mecanic local a fost calculat folosind un AFM (MFP-3D, Asylum Research, Santa Barbara, CA). Țesutul cartilajului a fost sondat folosind un consolă de siliciu (k

5,4 N/m 2; Novascan Technologies, Ames, IA) cu un indenter sferic borosilicat de 5 μm diametru care a fost calibrat zilnic. Regiunile de interes care înglobează un singur condrocit au fost identificate folosind microscopia cu fluorescență și situate la aproximativ 1-2 celule distanță de marginile exterioare ale secțiunilor pentru a evita artefactele de margine rămânând în afara cartilajului zonei profunde și a osului subcondral. Regiunea de analiză AFM a fost de 10 μm 2 și s-a efectuat o indentare la fiecare 0,5 μm pentru a da un număr total de 400 de indentări pe regiune. Eșantionul a fost indentat la o rată de 10 μm/s, deoarece studiile anterioare au arătat o variație mică sau deloc a valorilor modulului pentru viteze de indentare între 5 și 25 μm/s. 31 Indentarea a fost continuată până la atingerea forței de declanșare, 300 nN.

Deflexia în consolă și mișcarea z-piezo au fost înregistrate pentru fiecare punct de indentare din software-ul Asylum Research și analizate folosind un script MATLAB personalizat (The MathWorks, Natick, MA). Modulul elastic al țesutului a fost definit folosind un model Hertz modificat așa cum a fost descris anterior. 28,31–33 Extrapolarea punctului de contact a fost utilizată pentru a determina punctul în care consola a contactat suprafața. Imaginile de fluorescență au fost suprapuse pe hărțile de rigiditate pentru a identifica fiecare punct de indentare ca ECM sau PCM. Punctele de analiză din corpul celulei au fost excluse din analize ulterioare. Punctele de date au fost, de asemenea, excluse dacă depășeau de 2,5 ori media valorilor înconjurătoare; în acest caz, au fost înlocuite cu valoarea medie a punctelor adiacente. Pentru a trasa modulul în raport cu distanța față de centrul celulei, imaginea fluorescentă a fiecărei regiuni a celulei a fost pragată în MATLAB și s-au calculat moduli medii pentru fiecare inel gros de 0,5 μm definit radial începând de la marginea celulei. Datorită densității mari a condrocitelor din cartilajul murin, modulul mediu a fost trunchiat la valoarea maximă pentru a evita includerea regiunilor de PCM din condrocitele învecinate.

Analiză histologică și notare.

Capetele humerale au fost fixate în paraformaldehidă 4%, decalcificate folosind Calex II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și încorporate în parafină. Probele au fost secționate la 8 μm și colorate folosind safranin-O, verde rapid și hematoxilină pentru clasificarea OA sau hematoxilină și eozină pentru clasificarea sinovitei. Fenotipul cartilajului a fost clasificat folosind un sistem modificat de notare Mankin de către doi indivizi orbiți. 7,13 Această clasificare a constat din următoarele categorii: structura suprafeței cartilajului (0-11), dublarea marcajului (0-3), colorarea Safranin-O (0-8), clonele condrocitelor din cartilajul necalcificat (0-2), hipertrofice condrocite în cartilajul calcificat (0-2) și grosimea osului subcondral (0-2). Scorul total posibil a fost de 28. Inflamația sinovială a fost evaluată de doi marcatori orbi, folosind un sistem de notare stabilit. 13 Aceasta a constat din următoarele categorii: mărirea stratului celular de căptușeală sinovială (0-3) și densitatea celulelor din căptușeala sinovială (0-3). Grosimea cartilajului necalcificat și calcificat și a plăcii subcondrale au fost determinate folosind imagini histologice reprezentative. S-a luat o medie de cinci măsurători de grosime pentru fiecare îmbinare.

Analize statistice.

Semnificația dintre grupurile de dietă pentru rezultatele osoase și AFM a fost determinată de testele ANOVA unidirecționale și Tukey post hoc. Pentru scorurile de gradare histologică discrete, semnificația a fost determinată folosind un test Kruskal-Wallis. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Valorile aberante au fost determinate folosind un test ROUT (Q = 1%). Toate statisticile au fost efectuate în Prism 7.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

REZULTATE

Analiza MicroCT a regiunii trabeculare epifizare humerale (Figura 1A) nu a arătat nici un efect al compoziției dietetice a acizilor grași asupra BMD (Figura 1B) sau Tb.Th (Figura 1D). Fracțiunea volumului osos BV/TV (Figura 1C) și Tb.Sp (Figura 1E) au fost semnificativ diferite între grupurile de dietă. BV/TV s-a redus semnificativ atât în ​​grupul de dietă ω-6, cât și în grupul de grăsimi saturate, în timp ce Tb.Sp a crescut numai pentru grupul de grăsimi saturate singur comparativ cu grupul de dietă de control.

efectele

A) Suportul indică regiunea trabeculară analizată între placa osului subcondral și placa proximală de creștere. Bara de scalare: 1 mm. B) Densitatea minerală osoasă trabeculară (DMO). C) Fracțiunea volumului osos, volumul osos/volumul total (BV/TV). D) Grosimea trabeculară (Tb.Th). E) Separarea trabeculară (Tb.Sp). n = 12-15 pe grup de dietă. Date prezentate ca medie ± SEM. Grupurile care nu împărtășesc aceeași literă sunt semnificativ diferite față de ANOVA unidirecțional și testul post-hoc al lui Tukey, p Figura 2A). Modificări mai pronunțate ale densității minerale osoase pot fi observate în regiunea corticală distală, dar s-au găsit diferențe semnificative datorate dietei în ambele regiuni (Figura 2B și și 2C). 2C). Interesant este că dieta cu grăsimi saturate prezintă o densitate minerală osoasă mai mică în regiunea proximală, dar nu și în regiunea distală. În regiunea proximală, numai grupul de dietă ω-3 a avut o scădere a suprafeței (Figura 2D); cu toate acestea, toate dietele bogate în grăsimi au dus la o scădere semnificativă a ariei secțiunii transversale medii în regiunea distală față de controalele standard ale chow-ului (Figura 2E). Grosimea corticală a regiunii proximale din grupul ω-3 a fost, de asemenea, scăzută semnificativ din toate celelalte diete (Figura 2F), dar grosimea regiunii distale nu a prezentat dependență de dietă (Figura 2G).

A) Suporturile indică două regiuni diafizare analizate: proximal începe cu 0,5 mm sub capătul capului humeral și are o grosime de 0,5 mm, distal începe după tuberozitatea deltoidă și este gros de 0,4 mm. Bara de scalare: 1 mm. Densitatea minerală osoasă (BMD) pentru B) proximală și C) distală. Secțiunea transversală medie pentru D) proximal și E) distal. Grosimea corticală pentru F) proximal și G) distal. Date prezentate ca medie ± SEM. Grupurile care nu împărtășesc aceeași literă sunt semnificativ diferite unul de altul, ANOVA unidirecțional și testul post-hoc al lui Tukey, p Figura 3A) nu au arătat modificări semnificative ale valorilor modulului cartilajului nici pentru ECM în vrac, fie pentru PCM care înconjoară condrocitul (Figura 3C). Progresia modulului de la PCM mai moale la ECM mai rigidă nu a fost modificată în mod semnificativ de dietă, deși șoarecii hrăniți cu dieta SFA au arătat o tendință spre modul redus (Figura 3D). O hartă reprezentativă a rigidității (Figura 3B) arată PCM mai moale care înconjoară celula și progresia treptată către ECM mai rigidă.

A) Imagine fluorescentă a zonei testate. Punctul roșu indică locația de pornire a sondei AFM, caseta cyan săgeată indică zona și direcția de scanare a sondei. Bara de scalare: 20μm. B) Harta de rigiditate reprezentativă. Fiecare pixel reprezintă o măsurare a forței pentru fiecare zonă de 0,5 μm × 0,5 μm. C) Modulul lui Young a fost calculat în medie pentru ECM și pentru PCM. D) Progresia modulului lui Young în afara celulei în inele concentrice de 0,5 μm. Date prezentate ca medie ± SEM. Nu s-au observat diferențe semnificative statistic (ANOVA unidirecțional, p Figura 4A, iar imaginile mărite ale suprafeței cartilajului din fiecare grup de dietă sunt prezentate în Figura 4B. În timp ce scorul global modificat Mankin nu a arătat diferențe cu dieta (Figura 5A), două subcategoriile au variat în funcție de dietă. Numărul de condrocite hipertrofice din cartilajul calcificat (Figura 5B) a crescut semnificativ în grupele ω-6 și grăsimi saturate comparativ cu dietele ω-3 și de control. De asemenea, numărul clonelor condrocitelor din necalcificate cartilajul (Figura 5C) a fost semnificativ redus în dieta ω-6 față de toate celelalte grupuri de dietă. Coroborând fenotipul cartilajului absent, grosimile respective ale regiunilor cartilajului necalcificat (Figura 5D) și calcificat (Figura 5E) au fost, de asemenea, independente de dietă Cu toate acestea, grosimea plăcii osoase subcondrale măsurată din imaginile histologice a fost semnificativ redusă în dieta ω-3 comparativ cu toate celelalte grupuri de dietă (Figura 5F).

Roșu: proteoglicani, albastru: os și cartilaj. A) Capul complet humeral de la un șoarece pe dieta de control. Bara de scalare: 0,25 mm. B) Suprafețe reprezentative ale cartilajului pentru fiecare grup de dietă. Bara de scalare: 0,05 mm.

Este bine recunoscut faptul că formarea și calitatea oaselor pot, cel puțin, să depindă parțial de nivelurile de activitate (adică, încărcarea potențială pe schelet) 49. În ciuda faptului că nu am observat modificări semnificative ale activității locomotorii spontane la șoarecii hrăniți cu diete bogate în grăsimi sau de control în lucrările noastre publicate anterior, 10 nu este clar dacă locomoția spontană este un model optim pentru a investiga încărcarea greutății pe scheletul umărului. Pentru a examina modul în care nivelul de activitate afectează calitatea oaselor umărului, studiile viitoare pot dori să utilizeze teste comportamentale care sunt mai concentrate pe activitatea membrelor superioare, cum ar fi cățărarea verticală. 50

Aceste efecte minime ale dietei și obezității asupra structurii cartilajului au fost susținute de rezultatele că dietele noastre bogate în grăsimi nu au modificat proprietățile mecanice ale PCM și ECM. Am demonstrat anterior că modificările atât ale modulului ECM, cât și ale modulului PCM, precum și o schimbare a gradientului proprietăților mecanice de la PCM la ECM, reflectă degradarea matricei în OA, în special în apropierea condrocitelor individuale. 28 Deși aceste descoperiri sugerează că umărul nu este ușor susceptibil la OA indusă de obezitate, lipsa modificărilor cartilajului macro sau microscopic ar putea fi cauzată de alți factori. De exemplu, astfel de modificări pot apărea pe o perioadă mai lungă de timp decât 24 de săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, iar scala de timp a progresiei bolii, precum și gradul de deteriorare, pot fi specifice articulațiilor.

În concluzie, am observat o serie de modificări ale dietei în os din cauza obezității, în timp ce structura cartilajului și proprietățile mecanice au rămas relativ neschimbate. Studiile au arătat diferențe specifice articulațiilor ca răspuns la OA legată de obezitate, corelații fiind observate la genunchi și mâini, dar cu o corelație mică sau deloc pentru OA de șold și umăr. 21 În ciuda literaturii relativ rare pe OA a umărului, constatările noastre sunt în concordanță cu lipsa dovezilor clinice pentru obezitate ca factor de risc pentru OA de umăr, dar indică faptul că modificările osoase subiacente apar în acest model. Acest studiu pune bazele pentru o mai bună înțelegere a patogenezei OA a umărului, precum și legătura dintre obezitate și modificările țesuturilor musculo-scheletice ale umărului. Această lucrare oferă motive suplimentare pentru examinarea rolului obezității și a intervenției dietetice în sănătatea sistemului musculo-scheletic, inclusiv alte articulații, cum ar fi umărul, în plus față de genunchi și șold.

MULȚUMIRI

Autorii îi mulțumesc Sara Oswald pentru că a oferit suport tehnic de redactare a manuscrisului, iar Dr. Kelsey Collins pentru discuții și asistență cu evaluarea comună. Acest studiu a fost susținut parțial de granturile NIH AR50245, AR48852, AG15768, AR48182, AG46927,> AR073752, OD10707,> AR060719, Centrul de Cercetare Musculoscheletală a Universității Washington (NIH P30 AR057235), Fundația pentru Artrită și Fundația Nancy Taylor pentru Chronic. Boli.