Abstract

fundal

Compușii din dezvoltarea clinică pentru steatohepatita nealcoolică (NASH) îmbunătățesc histopatologia hepatică în modele de șoarece obez induse de dietă ale NASH confirmate cu biopsie. Deoarece secțiunea de biopsie utilizată pentru evaluarea histopatologică reprezintă doar ob / Lep ob șoarecii au fost hrăniți cu dieta NASH (AMLN) hepatică de amilină timp de 16 săptămâni înainte de stratificare în grupuri de tratament utilizând o evaluare bazată pe biopsie a nivelurilor de colagen de tip I αI (col1a1). Șoarecii au fost tratați timp de 8 săptămâni cu fie vehicul (PO, QD), liraglutidă (0,4 mg/kg, SC, QD), elafibranor (30 mg/kg, PO, QD) sau INT-767 (10 mg/kg, PO, QD). Evaluarea histologică cantitativă terminală a lipidelor hepatice (colorarea hematoxilinei-eozinei), a inflamației (imunohistochimia galectinei-3 (IHC); gal-3) și a fibrozei (col1a1 IHC) a fost efectuată pe biopsii hepatice terminale și comparată cu secțiunile seriale eșantionate stereologic care se întind pe lobul lateral medial, stâng și drept al ficatului.

Rezultate

Distribuția lipidelor hepatice și a fibrozei a fost semnificativ consistentă între lobi, în timp ce inflamația a arătat o oarecare variabilitate. În timp ce INT-767 și liraglutida au redus semnificativ greutatea totală a ficatului cu 20 și, respectiv, 48%, elafibranorul a avut tendința de a exacerba hepatomegalia în Grozav ob / Lep ob -Șoareci NASH. Toți cei trei compuși au redus semnificativ conținutul relativ de lipide hepatice pe bază de biopsie. Elafibranor și INT-767 au redus semnificativ nivelurile relative de gal-3 pe bază de biopsie (P

fundal

Prevalența bolii hepatice grase nealcoolice (NAFLD) crește la nivel mondial, alături de incidența crescută a diabetului și a obezității [1, 2]. NAFLD variază de la ficat gras nonalcoolic benign (NAFL) cu steatoză simplă până la steatohepatită nealcoolică (NASH) și ciroză [3,4,5], care este estimată ca fiind principala cauză a bolii hepatice în stadiu final în câțiva ani. [6,7,8]. Până în prezent nu există un tratament autorizat pentru NASH, cu toate acestea, sunt în curs de desfășurare numeroase studii clinice [9]. Cei mai avansați sunt acidul obeticholic (un agonist al receptorului farnesoid X (FXR)), elafibranorul (un receptor activat cu proliferator dublu peroxizom (PPAR) -α/δ agonist), selonsertib (un inhibitor al kinazei 1 care reglează semnalul apoptozei (ASK1)), și liraglutidă (un analog cu acțiune lungă de tip peptidă-1 (GLP-1) asemănător glucagonului) [9].

În plus față de sarcina dificilă de a dezvolta terapii pentru NASH, datele clinice și de urmărire sunt împiedicate de nevoia nesatisfăcută de instrumente de diagnostic și de prognostic neinvazive fiabile [10, 11]. Dezvoltarea NASH este imprevizibilă și variază atât în ​​ceea ce privește severitatea bolii, cât și ratele de progresie [12]. Procedurile de imagistică neinvazivă, inclusiv ultrasonografia, imagistica prin rezonanță magnetică (RMN) și elastografia prin rezonanță magnetică (MRE) au arătat potențial în diagnosticarea NAFL și pot fi efectuate în mod repetat în timpul perioadei de monitorizare a bolii [11]. Cu toate acestea, utilitatea lor este inadecvată din cauza lipsei de sensibilitate pentru a diferenția nivelurile intermediare de severitate a fibrozei, disponibilitatea lor limitată și costurile asociate [11]. Testele chimice ale sângelui foarte sensibile și predictive pentru biomarkerii surogat circulanți ai leziunilor hepatice nu au ajuns încă la aprobarea FDA [11]. În consecință, biopsiile hepatice invazive și riscante rămân în continuare standardul de aur pentru stadializarea și clasificarea NASH și pentru monitorizarea eficacității medicamentelor în studiile clinice [13,14,15,16,17].

Pentru a ajuta la dezvoltarea terapeuticii farmaceutice, modelele animale care reflectă fenotipul clinic NASH sunt de cea mai mare importanță. Au fost dezvoltate mai multe modele și sunt clasificate în general în modele induse de dietă, induse chimic sau genetice (knockout sau transgenice) [18]. Diferite diete obezogene de tip occidental s-au dovedit a promova un fenotip NASH la șoareci, deși severitatea bolii este adesea ușoară [19]. Cu toate acestea, atunci când ținute ≥ 26 de săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, fructoză și colesterol (dieta NASH din ficatul Amylin; AMLN [20, 21]), șoarecii C57BL/6J s-au dovedit a dezvolta semnele patologice hepatice ale NASH, inclusiv steatoză, inflamație lobulară și degenerescență cu balon, precum și fibroză ușoară până la moderată [21,22,23,24,25,26]. Aceste caracteristici sunt accentuate și mai mult în cazul deficienței de leptină Grozav ob / Lep ob șoareci [20, 25, 27, 28]. Eficacitatea farmacologică a obiectivelor metabolice și hepatice a fost deja caracterizată pe scară largă în aceste modele [20, 26, 29].

S-a demonstrat anterior că Elafibranor, INT-767 și liraglutida induc diverse efecte farmacodinamice asupra histopatologiei hepatice [20, 26, 29,30,31,32,33,34]. Cei trei compuși reprezintă trei clase de medicamente complet diferite, cu trei mecanisme de acțiune diferite [29, 35,36,37] și sunt, de asemenea, cunoscuți că afectează masa hepatică totală. În timp ce descoperirile bazate pe biopsii de țesuturi mici sunt încurajatoare, niciun studiu nu a folosit anterior eșantionare stereologică standard de aur pentru a evalua omogenitatea morfometriei hepatice la nivelul lobilor ficatului și nici pentru a evalua validitatea evaluărilor biopsiei hepatice pentru a reflecta modificările induse farmacologic pe întregul ficat de șoarece. Acest studiu își propune să evalueze dacă analiza imaginii cantitative bazată pe biopsie reflectă eficient remodelarea ficatului întreg după tratamentul medicamentos prin comparație cu analiza imaginii digitale cantitative bazate pe stereologie a întregului ficat.

Metode

Animale și amenajări experimentale

Bărbat B6.V-Grozav ob/JRj (Grozav ob / Lep ob ) șoareci (cu vârsta de 5 săptămâni) au fost obținuți de la JanVier (JanVier Labs, Franța), iar grupul a găzduit 10 animale pe cușcă într-un mediu controlat (12/12 h ciclu de lumină întunecată, 21 ± 2 ° C temperatura camerei și 50 % ± 10% umiditate). Șoarecii aveau ad libitum acces la dieta AMLN (D09100301, Research Diets, New Brunswick, Statele Unite) [21], conținând 40% grăsimi (18% trans-grăsimi), 40% carbohidrați (20% fructoză) și 2% colesterol sau chow regulat pentru rozătoare (Altromin 1324, Brogaarden, Danemarca), precum și apă de la robinet. Șoarecii au fost ținuți pe o dietă cu 16 săptămâni înainte de o perioadă de intervenție farmaceutică de opt săptămâni (vezi mai jos). Pe parcursul perioadei de tratament, greutatea corporală a fost măsurată zilnic. Toate manipulările, tratamentele și eutanasierea animalelor au fost efectuate în conformitate cu protocolul aprobat de Agenția Națională Daneză pentru Protecția Animalelor Experimentale, utilizând principii acceptate la nivel internațional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (licența nr. 2013-15-2934-00784, Inspectoratul pentru experimente pe animale, Danemarca).

Intervenție farmacologică

Prelucrarea țesuturilor și analize morfometrice

Întregul ficat a fost cântărit și împărțit în lobul lateral stâng, medial și lateral drept, care au fost apoi cântărite individual. Ulterior, lobul lateral stâng a fost împărțit în două părți egale, din care a fost obținută o biopsie terminală de formă dreptunghiulară dintr-o parte. Jumătatea rămasă, precum și lobii laterali mediali și drepți au fost folosiți pentru analize bazate pe stereologie (Fig. 1a-c).

valabilitatea

Vizualizarea secțiunilor stereologice și analiza morfometrică. Desen schematic al lobiilor hepatici folosiți pentru stereologie (A); lobul lateral stâng (1), incluzând locul pre-biopsiei (roșu), post biopsie (pătrat negru) și secțiunea de stereologie (jumătate din lobul marcat de linia punctată), lobul medial (2) și lobul lateral drept (3) )), precum și lobul caudat (4) și procesul papilar (5). Analiza morfometrică a; steatoza (b) pe secțiuni colorate cu hematoxilină și Eozină Y, precum și imunohistochimie (IHC) a galectinei-3 (gal-3)c), și de tip I colaj lanț α1 (col1a1) (d). Rozul este atribuit steatozei, gri închis atribuit țesutului hepatic, galben atribuit gal-3 colorant pozitiv și verde atribuit col1a1 colorant pozitiv. Evaluările morfometrice sunt efectuate utilizând software-ul Visiomorph (Visiopharm, Hoersholm, Danemarca), prin adnotare pixel, excluzând vasele în funcție de dimensiune (albul este atribuit vaselor), precum și excluzând vasele din jurul gal-3 și col1a1 pozitive Bară de scară = 150 μm

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind fie analiza de varianță cu două direcții (ANOVA) urmată de testul post-hoc al Turciei, fie ANOVA unidirecțional cu testul post-hoc al lui Dunnett (p

Rezultate

Variabilitatea intra și interlobulară

Variabilitatea intra și interlobulară a fost analizată la cinci șoareci tratați cu vehicul NASH, deoarece calculele puterii au estimat acest lucru suficient. Analizele morfometrice ale lipidelor hepatice au evidențiat o variabilitate intra-lobă scăzută (CVi de 0,02 până la 0,08) și o variabilitate ușor mai mare între lobi (CV inter-lob de 0,06-0,08) (Fig. 2a). Variabilitatea biologică între animale a reprezentat 43,7% din varianța totală, în timp ce variabilitatea intra-lobă a reprezentat doar 11,7%. Nu s-au observat diferențe semnificative în lipidele hepatice între biopsii și lobi individuali (Fig. 2b).

Cele mai evidente diferențe în variabilitatea intra-lobă au fost observate pentru morfometria gal-3 cu un CVi de 0,04 până la 0,47 (fig. 2c). Mai mult, nivelurile de gal-3 au fost semnificativ mai mari în lobul medial, în comparație cu lobul lateral stâng și drept, și în comparație cu nivelurile de gal-3 pe bază de biopsie (Fig. 2d). Variabilitatea biologică a reprezentat 8% din varianța totală a gal-3, în timp ce variabilitatea intra-lobă a reprezentat 67,8%.

Variabilitatea intra-lobulară pentru col1a1 a fost estimată la 0,06-0,26 (Fig. 2e). În ceea ce privește conținutul de lipide hepatice, cel mai mare discriminator pentru varianța col1a1 a fost variabilitatea biologică la șoareci, reprezentând 52,9% din varianța totală, în timp ce varianța intra-lobă a reprezentat doar 14,7%. În general, estimările nivelurilor totale de col1a1 în lobi individuali au fost semnificativ mai mici decât evaluările bazate pe biopsie (Fig. 2f).

Efecte asupra greutății corpului și a ficatului

Grozav ob / Lep ob -Grupurile NASH erau obeze înainte de tratament (53 ± 1,1 g, n = 12), dar a arătat o greutate corporală mai mică comparativ cu vârsta potrivită hrănită cu chow Grozav ob / Lep ob șoareci tratați cu vehicul (59,6 ± 0,8 g, n = 10) (Fig. 3a). Tratamentul cu liraglutidă și elafibranor a redus progresiv greutatea corporală (Fig. 3a), cu o pierdere în greutate maximă de aproximativ 10% comparativ cu valoarea inițială și aproximativ 20% față de dozarea vehiculului (Fig. 3b). INT-767 a încetinit rata creșterii în greutate corporală, dar nu a redus greutatea corporală sub nivelurile inițiale în Grozav ob / Lep ob -Șoareci NASH (Fig. 3b).

Grozav ob / Lep ob -Șoarecii NASH au avut hepatomegalie marcată în comparație cu martorii hrăniți cu chow (Fig. 3c-f). Atât liraglutida cât și INT-767 au redus semnificativ greutatea totală a ficatului (Fig. 3c) și greutatea lobului lateral drept (Fig. 3f). Un model similar a fost observat pentru lobii laterali și mediali stângi, obținând semnificație statistică numai pentru liraglutidă (Fig. 3d și e). Tratamentul cu Elafibranor nu a afectat semnificativ greutatea ficatului.

Analize de biopsie terminală și morfometrie hepatică întreagă

Toate tratamentele au redus semnificativ conținutul relativ de lipide în biopsie (Fig. 4a) și în întregul ficat (Fig. 4b), fiind cel mai pronunțat pentru INT-767 și elafibranor. La încorporarea modificărilor în greutatea totală a ficatului, efectul asupra masei lipidice totale a fost și mai vizibil, indiferent de biopsie (Fig. 4c) sau de prelevare de probe pe bază de ficat întreg (Fig. 4d). Acest lucru a fost, de asemenea, evident din sub-analizele lobilor individuali (Fig. 4e-g, Tabelul 1).

INT-767 și elafibranor au redus semnificativ nivelurile relative de gal-3 în biopsie (Fig. 5a) și în întregul ficat (Fig. 5b), în timp ce liraglutida nu a avut niciun efect asupra nivelurilor relative de gal-3 (Fig. 5a-b). Cu toate acestea, atunci când sunt exprimate ca valori totale, toți compușii au redus masa gal-3, indiferent de metoda de eșantionare (Fig. 5c-d) și de pe toți lobi (Fig. 5e-g, Tabelul 1).

Niciunul dintre tratamente nu a redus în mod eficient col1a1 relativă bazată pe biopsie (Fig. 6a), în timp ce INT-767 a redus col1a1 relativă a ficatului întreg (Fig. 6b). Atunci când sunt exprimate ca valori totale, INT-767 și liraglutidă, dar nu și elafibranor, au redus semnificativ nivelurile totale de col1a1 hepatică, indiferent de metoda de prelevare, adică biopsie- (Fig. 6c) sau cuantificare bazată pe stereologie (Fig. 6d). Numai INT-767 a redus semnificativ masa col1a1 pe toți lobi (Fig. 6e-f) și a exercitat cel mai pronunțat efect de reducere a col1a1 în rândul claselor de medicamente testate (Tabelul 1). În general, reducerea masei col1a1 a fost mai mare în analiza bazată pe stereologie comparativ cu analiza bazată pe biopsie.

Discuţie

Prezentul studiu a avut ca scop verificarea validității unei biopsii hepatice, reprezentând mai puțin de 1% din totalul ficatului, pentru a reflecta remodelarea bolii hepatice întregi după tratamentul farmaceutic la bărbați Grozav ob / Lep ob -Șoareci NASH. Prin compararea analizelor morfometrice pe biopsii cu secțiuni eșantionate stereologic pe întregul ficat, demonstrăm că biopsia este un reprezentant general al stării ficatului întreg și este aplicabilă pentru evaluarea preclinică a studiilor de intervenție farmacologică. Cu toate acestea, în special, demonstrăm că efectele induse farmacologic asupra greutății ficatului ar trebui luate în considerare cu atenție atunci când se compară criteriile finale legate de NASH în studiile preclinice.

În timp ce conținutul de lipide hepatice a arătat variații mici în interiorul și între lobi, variabilitatea intra-lobulară a fost mai evidentă atât pentru nivelurile relative de gal-3, cât și pentru nivelurile de col1a1. Această diferență nu este surprinzătoare și subliniază necesitatea de a face biopsii în aceeași parte a lobului atunci când se compară dinamica țesuturilor între diferite animale sau de a utiliza principii de eșantionare stereologică imparțială care acoperă întregul ficat. Diferențele dintre nivelurile de col1a1 sunt legate în principal de fracțiunea capsulei Glisson din secțiunea de țesut. Capsula Glisson [40], un strat colagenos care acoperă ficatul, crește în grosime în timpul progresiei fibrozei [41, 42]. În consecință, nivelurile de col1a1 au fost semnificativ mai mari la părțile apicale comparativ cu palmele care conțin un raport mai mare de părți centrale ale lobului. Același motiv se poate aplica pentru variabilitatea gal-3, deoarece gal-3 derivat din macrofage este cunoscut a fi legat de miofibroblaste și, prin urmare, fibroza [43, 44].

În cele din urmă, trebuie precizat că analizele prezentate aici s-au bazat pe o evaluare cantitativă a imunohistochimiei gal-3 și col1a1. Acești „pan-markeri” de inflamație și fibroză sunt utilizați pe scară largă în cercetările preclinice și clinice, dar, desigur, nu pot reprezenta toate inflamatorii ale remodelării matricei extracelulare în timpul dezvoltării NASH. În consecință, validitatea eficacității medicamentului pe bază de biopsie prezentată aici ar trebui luată în considerare cu prudență pentru alți markeri.

Concluzie

În concluzie, raportăm că o biopsie hepatică poate fi considerată un reprezentant pentru remodelarea care are loc în întregul ficat al Grozav ob / Lep ob -Șoarecii NASH după tratament farmaceutic, deși modificările sunt ușor diferite utilizând o evaluare stereologică aprofundată a întregului organ, așa cum se dovedește aici pentru liraglutidă și INT-767 pentru evaluările col1a1. Într-un studiu recent, biopsiile hepatice repetate au fost extrase din lobul lateral stâng, lobul drept medial și lobul stâng medial la șoareci pe o perioadă de trei luni [54]. Deși aceste date au arătat că biopsiile hepatice repetate de la lobi diferiți erau fezabile, datele noastre sugerează că măsurători continue pe bază de biopsie ar trebui efectuate în același lob. În cele din urmă, subliniem importanța introducerii efectelor asupra remodelării totale a ficatului atunci când se evaluează histomorfometria hepatică, deoarece eliminarea steatozei sau a hepatomegaliei ar influența valorile relative.