A contribuit în mod egal la această lucrare cu: R. Taylor Pickering, Mi-Jeong Lee

depunerii

Centrul de obezitate pentru afiliere, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Boston, Boston, MA, Statele Unite ale Americii

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: R. Taylor Pickering, Mi-Jeong Lee

Centrul de obezitate pentru afiliere, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Boston, Boston, MA, Statele Unite ale Americii

Centrul de obezitate pentru afiliere, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Boston, Boston, MA, Statele Unite ale Americii

Afiliere Institutul de Științe Translaționale Clinice, Universitatea din Boston, Boston, MA, Statele Unite ale Americii

Centrul de obezitate pentru afiliere, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Boston, Boston, MA, Statele Unite ale Americii

  • R. Taylor Pickering,
  • Mi-Jeong Lee,
  • Calypso Karastergiou,
  • Adam Gower,
  • Susan K. Fried

Cifre

Abstract

Citare: Pickering RT, Lee M-J, Karastergiou K, Gower A, Fried SK (2016) Depot Efectele dependente ale dexametazonei asupra expresiei genice în țesuturile adipoase subcutanate umane și abdominale de la femeile obeze. PLoS ONE 11 (12): e0167337. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167337

Editor: Marià Alemany, Universitatea din Barcelona, ​​Facultatea de Biologie, SPANIA

Primit: 10 iunie 2016; Admis: 11 noiembrie 2016; Publicat: 22 decembrie 2016

Disponibilitatea datelor: Valorile medii ale expresiei din microarray pot fi găsite în figurile suplimentare. Toate celelalte date microarray sunt depuse în GEO. ID-ul Geo Series asociat studiului nostru este GSE88966.

Finanțarea: Finanțarea a fost asigurată de Institutele Naționale de Sănătate (https://www.nih.gov/), RO1 DK08084, T32 DK007201, P30DK46200 și U54 TR001012.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Masa grăsimii viscerale, definită ca acele depozite situate în cavitatea abdominală și asociate cu organele digestive (adică omentale și mezenterice), este asociată cu risc de diabet de tip 2 și boli cardiovasculare atât la bărbați, cât și la femei [1]. Glucocorticoizii (GC) promovează acumularea preferențială de grăsime în depozitele viscerale, așa cum se observă în mod clar în sindromul Cushing [2-4]. Diferențele depozitului în ratele de rotație a triacilglicerolului (TAG), inflamația și celularitatea adipocitelor sunt bine documentate la modelele umane și la șoareci [5-7], dar mecanismele care stau la baza variațiilor dependente de depozit în acțiunea GC și mecanismele care leagă dimensiunea acestui depozit până la disfuncția metabolică sistemică rămân incomplet înțelese.

GC integrează o mare varietate de semnale de reglementare care controlează proliferarea celulară, metabolismul și inflamația [8]. Activitatea receptorului GC (GR) este de tip celular, dependent de genă și doză și este reglementată de mai multe semnale [9, 10]. Țesutul adipos include mai multe tipuri de celule, inclusiv preadipocite, celule endoteliale, celule imune și adipocite, toate fiind vizate de GC [11]. Astfel, în plus față de acțiunile GC directe în fiecare tip de celulă, interacțiunile paracrine și endocrine contribuie probabil la diferențele depozitelor în acțiunile GC asupra expresiei genetice și, prin urmare, asupra funcției tisulare. Deși modelele de cultură celulară oferă informații mecaniciste neprețuite despre fiecare tip de celulă, compoziția celulară a diferitelor depozite variază și compoziția matricei sale extracelulare (ECM) contribuie, de asemenea, la diferențele depozitelor în acțiunile GC [12]. Astfel, dezlegarea detaliilor moleculare ale diafragmei între tipurile de celule și căile din țesutul adipos intact este complexă. Avantajul culturii de organe în acest context este că acest sistem oferă un context tridimensional relevant fiziologic pentru analiza acțiunii hormonului țesutului adipos uman și compararea diferențelor de depozit.

Pentru a obține o imagine integrată a mecanismelor prin care GC modulează funcția dependentă de depozit, am ales să folosim un sistem de cultură de organe în care expresia genelor adipocite cheie (de exemplu, ADIPOQ, LEP, GLUT4, LPL) este reglată sinergic de GC și insulină, și menținut la nivelurile inițiale timp de cel puțin 7 zile [13, 14]. Studiile noastre anterioare au abordat efectele globale ale GC asupra transcriptomului adipos în culturile de organe din cele două depozite centrale adipose centrale la om, visceral (omental, Om) și abdominal subcutanat (Abdsc) utilizând un microarray de 12K [14]. Aceste studii au testat o singură concentrație de agonist GR de tip II Dex (25 nM), adăugată în prezența insulinei de 7 nM [14]. Dex reglementat

20% din genele exprimate adipos și multe gene și căi, cum ar fi cele care promovează sinteza TAG și mediază acțiunea insulinei, au fost afectate în mod similar atât în ​​Om, cât și în Abdsc, dar amploarea efectelor a fost adesea dependentă de depozit [14]. O limitare a acestui studiu anterior a fost că efectele Dex sunt foarte dependente de concentrație [9] și am documentat anterior o sensibilitate mai scăzută la concentrațiile de Dex care stimulează submaximal expresia genei LPL și a leptinei [13, 15].

GR interacționează cu co-activatori sau co-represori pentru a exercita efecte complexe asupra rețelelor transcripționale. Mecanismele prin care GR interacționează direct cu siturile lor de legare care îmbunătățesc/reprimă selectiv transcrierea grupurilor de gene apar rapid din studiile modelelor de cultură celulară [9, 16, 17]. Către obiectivul pe termen lung de a înțelege mecanismele prin care GC modulează diferențial expresia genelor în micro-mediile complexe ale țesuturilor adipose viscerale și subcutanate umane, cele două obiective principale ale studiului curent au fost: 1) identificarea transcrierilor care sunt sensibil sensibile la un interval de concentrații de Dex (0, 1, 10, 25, 1000 nM) în Om și Abdsc și 2) pentru a identifica mARN-urile reglementate de GC care pot juca roluri neprevăzute în biologia adipoasă dependentă de depozit, adică au fost exprimate în principal doar într-un singur depozit și au răspuns la Dex în acel depozit. Am folosit Dex pentru studiul mecanicist curent deoarece este un agonist GR specific și, spre deosebire de cortizol, nu poate fi inactivat sau interacționa cu receptorul mineralocorticoid (MR). În acest scop, am folosit microarrays Affymetrix Human Gene 1.0 ST care reprezintă aproape toate

20.000 de gene umane și o concentrație mai semnificativă din punct de vedere fiziologic de insulină (0,7 nM) comparativ cu studiul nostru anterior [14].

Materiale și metode

Colectie de mostre

Țesutul adipos a fost prelevat de la intervenții chirurgicale elective la voluntari lipsiți de diabet, cancer și boli inflamatorii prin dosarul medical și fără a lua medicamente care ar putea afecta metabolismul, așa cum s-a descris anterior [15]. Tabelul 1 prezintă caracteristicile subiecților al căror țesut a fost utilizat pentru microarray și studii de urmărire. Toate studiile au fost realizate în cadrul protocoalelor aprobate de Consiliul de revizuire instituțională de la Boston Medical Center. Toți subiecții au semnat consimțământul informat.

Prelucrarea țesuturilor

Imediat după excizie, o mică parte din țesut (

200 mg) a fost congelat rapid în azot lichid. Restul a fost transportat la laborator la temperatura camerei Mediu 199, tocat în fragmente de 5-10 mg, clătit rapid în soluție salină 0,9% și

300-400 mg au fost plasate în cultura de organe în 15 ml de mediu 199 suplimentat cu 0,7 nM insulină plus 0, 1, 10, 25 sau 1000 nM Dex pentru 7d. Culturile au fost re-hrănite la fiecare două zile și cu o zi înainte de recoltare pe data de 7 [18].

Expresia genelor

ARN-ul total a fost izolat cu reactiv Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA), curățat cu RNeasy MiniElute Cleanup Kit (Qiagen, Germantown, MD) și utilizat pentru microarrays și PCR cantitativ (qPCR). Diferențele de depozit în nivelurile de ARNm în țesutul înghețat rapid au fost verificate prin qPCR. ARN-ul total a fost transcris invers utilizând trusa de sinteză a ADNc-catenă Transcriptor First (Roche, Indianapolis, IN) și qPCR a fost efectuat pe un LightCycler 480 II (Roche) cu sonde TaqMan disponibile în comerț (Life Technologies). Ciclofilina A (PPIA) a fost utilizată ca genă de referință și s-au calculat nivelurile relative de expresie.

Microarrays

Matricile Human Gene 1.0 ST au fost utilizate pentru a profila expresia genei în 3 probe independente pereche de Om și Abdsc, după cultură cu Dex 0, 1, 10 și 1000 nM. Două probe au fost reunite de la doi donatori diferiți cu caracteristici similare și magnitudinea efectului Dex pentru a crește GILZ și a reduce expresia IL-6 (prin qPCR), iar o probă a reprezentat un singur donator (Tabelul 1). Rezultatele matricei (transformate în log2) au fost normalizate împreună utilizând algoritmul Robust Multiarray Average și un fișier de definiție a cipului care mapează sondele din matrice la identificatori unici de gen Entrez.

Analiza de îmbogățire a setului de gene (GSEA)

Pentru a determina căile biologice reglementate de fiecare concentrație de Dex în fiecare depozit, am calculat schimbarea de ori pentru valorile normalizate ale expresiei genelor în depozitul Om și Abdsc la fiecare concentrație de Dex în comparație cu controlul (0 Dex). Modificarea medie a pliurilor între subiecți pentru fiecare genă pentru fiecare pereche depozit-doză a fost utilizată pentru analiza GSEA Preranked (Ver. 2.1.0, Broad Institute [19, 20]). Au fost interogate bazele de date KEGG, Reactome, Biocarta și PID. Deoarece a existat o suprapunere substanțială pentru căile și listele de gene îmbogățite semnificativ, sunt prezentate doar rezultatele KEGG. Analizele bazate pe date clasificate în funcție de valoarea T pentru testul T asociat au dat rezultate similare (nu sunt prezentate). Căi KEGG reglementate semnificativ în sus și în jos (valori FDRq). Analiza clusterului a fost efectuată cu software-ul JMP 10 (utilizând setări complete, cu 1 sau 2 căi, scalate).

Nivelurile de expresie ale genelor de interes selectate au fost verificate de qPCR folosind 7 probe Om și Abdsc pereche. Datele sunt normalizate prin expresia genei PPIA (2 -ΔCT) și prezentate ca media și SEM a abundenței relative. Toate valorile au fost transformate în log înainte de analiza statistică. Efectul Dex într-un depozit a fost testat cu o singură măsură repetată ANOVA (pe doză), cu teste t pereche post-hoc, după cum s-a indicat, în fiecare depozit. Testele t asociate au fost utilizate pentru a compara valorile în depozitele Abdsc și Om la subiecți.

Rezultate

Folosind o abordare de modelare mixtă liniară și o limită conservatoare a FDRq Fig 1. qPCR verificarea efectelor dependente de concentrație și depozit ale glucocorticoizilor asupra genelor țintă selectate, cunoscute ale glucocorticoizilor.

(A) PCK1, (B) LPL, (C) GILZ și (D) IL-6. Datele sunt medii ± SEM, n = 5-7 subiecți independenți. Axa X este o scară de jurnal. Diferențele semnificative ale depozitelor la fiecare [Dex] sunt indicate de un asterisc * (*, p Fig. 2. Grafic paralel care ilustrează analiza cluster a genelor care au prezentat o interacțiune Depot * [Dex].

460 de gene care au prezentat o interacțiune semnificativă între Depot și [Dex] și valori de expresie peste un prag de 20 pentru cel puțin o concentrație de Dex într-un depozit au fost incluse într-o analiză ierarhică nesupravegheată (software JMP 10), după cum este descris Metode. Este prezentată analiza cu 10 clustere.

Clusterizare bidirecțională: Clusterizarea bidirecțională (Depot și [Dex]) a indicat că, în general, valorile atât pentru controlul Om, cât și pentru Om Dex 1 nM grupate cu control Abdsc (0 Dex). Această constatare indică faptul că valorile Om 1 nM au fost mai asemănătoare cu controlul Om (0 Dex), dar că Abdsc cultivat cu 1 nM Dex a fost diferit de controlul Abdsc și grupat cu Abdsc 10 și 1000 nM și este în concordanță cu concluzia că în general Omul este mai puțin sensibil la o concentrație scăzută de Dex. Dendrograma grupată în două direcții este prezentată în S1 Fig.

qPCR verificarea transcrierilor care arată răspunsul depozit la Dex în cultura de organe.

Folosind eșantioane individuale de la 5-7 subiecți, am verificat (cu qPCR) diferențele de depozit în reglarea Dex a două gene care au fost mult mai puternic exprimate la momentul inițial în Om și au rămas mai mari în ciuda suprimării de către Dex (INHBA și GREM1, Fig 3A și 3B ), și două gene care au fost exprimate la niveluri foarte scăzute în Abdsc și crescute de Dex numai în Om (PKHD1L1 și ITLN1, Fig 3C și 3D). În plus, am confirmat interacțiunea clară a [Dex] și Depot pentru ITGB8 (Fig 3E). Această genă a fost suprimată de Dex numai în Abdsc, în timp ce tinde să crească ca răspuns la creșterea Dex în Om, creând o diferență de depozit la concentrații mai mari de Dex. De asemenea, am verificat că nivelurile de ARNm de NRN1 au fost foarte scăzute în Om și au crescut cu Dex doar în Abdsc (Fig 3F).

Transcrierile pentru verificare au fost selectate din punct de vedere biologic, diferențe mari ale depozitelor în valorile inițiale și/sau amploarea efectelor Dex: (A) INHBA, (B) GREM1, (C) PKHD1L1, (D) ITLN1, (E) ) ITGB8 și (F) NRN1. Diferențele de depozit sunt indicate de asteriscuri (* p Fig 4. Diferențele de depozit în probele congelate rapid de Om și Abdsc reflectă modelele observate în țesuturile cultivate cu Dex.