1 Școală Absolventă de Științe ale Vieții și Mediului, Universitatea Prefecturală din Kyoto, 1-5 Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Japonia

2 Departamente de Anatomie și Biologie Celulară, Facultatea de Medicină, Colegiul de Medicină din Osaka, 2-7 Daigaku-machi, Takatsuki, Japonia

3 Laborator de chimie biometabolică, Școala de Științe ale Sănătății, Facultatea de Medicină, Universitatea Ryukyus, 207 Uehara, Nishihara, Japonia

4 Departamentul de Științe ale Materialelor și Vieții, Școala Absolventă de Inginerie, Universitatea Osaka, 2-1 Yamadaoka, Suita, Japonia

Autor corespondent: Yuichi Koga
Departamentul de Științe ale Materialelor și Vieții
Școală postuniversitară de inginerie, Universitatea Osaka
2-1 Yamadaoka, Suite, Osaka 565-0871, Japonia
Tel: +81-6-6879-7443
Fax: +81-6-6879-7443
E-mail: [e-mail protejat]

Data primirii: 22 iulie 2015; Data acceptată: 25 august 2015; Data publicării: 31 august 2015

Citare: Hirata A, Sakudo A, Takano K, Kanaya S, Koga Y (2015) Efectele surfactantului și a proteazei hipertermabile asupra infectării omogenizării creierului de șoarece infectat cu scrapie. J Biotechnol Biomater 5: 194. doi: 10.4172/2155-952X.1000194

Vizitați pentru mai multe articole similare la Jurnal de biotehnologie și biomateriale

Abstract

PrP Sc este considerat a fi agentul infecțios al EST, iar inactivarea infectivității PrPSc fără utilizarea reactivilor puternici este dificilă. Deși PrPSc este o proteină rezistentă la protează, ea poate fi degradată in vitro de proteaza hipertermofilă (Tk-subtilisin) la temperaturi peste 65 ° C prin efectul sinergic al destabilizării termice a PrP și prin activitatea proteolitică ridicată a proteazei termostabile. Cu toate acestea, modificarea infecțiozității PrPSc protejat-digerat este încă necunoscută. Prin urmare, am folosit omogenat de creier de șoarece care conține PrPSc (SBH) într-un test biologic pentru a investiga pierderea infectivității după digestia Tk-subtilisinei. În mod surprinzător, SBH digerat cu Tk-subtilisină a păstrat un nivel ridicat de infectivitate. În ciuda acestui fapt, Tk-subtilisina ar putea fi încă utilizată pentru decontaminare în condiții de denaturare puternică a proteinelor, cum ar fi în prezența SDS.

Cuvinte cheie

Protează; Termostabil enzimă; Prion; Scrapie; Tksubtilisin

Abrevieri

PrP: Prion Prion; PrP Sc: PrP asociat scrapiei; PrP C: PrP celular; EST: Encefalopatie spongiformă transmisibilă; CJD: Boala Creutzfeldt - Jakob; SBH: Mouse Scrapie (Strain Chandler) Brain Homogenate; PK: Proteinaza K; SDS: Dodecil sulfat de sodiu; GdnHCI: clorhidrat de guanidină; TDT: Ditiotreitol; SDW: Apă distilată sterilizată

Introducere

O proteină prionică anormală cu o conformație bogată în foaie β, proteină prionică asociată cu scrapie (PrP Sc) [1], este componenta proteică majoră a unui prion infecțios asociat cu encefalopatii spongiforme transmisibile (EST) [2]. PrP se distinge de PrPC și PrP Sc prin infectivitatea sa și au proprietăți fizice diferite, cum ar fi sensibilitatea și solubilitatea Proteinazei K. PrP Sc este parțial rezistent la digestia Proteinazei K și favorizează formarea diferiților oligomeri [1,3]. PrP Sc se formează din PrPC prin schimbarea sa structurală de la o conformație bogată în α la o conformație bogată în β [4]. PrP Sc induce schimbarea structurală a PrPC prin legare și fiind un șablon al unei noi molecule PrP Sc. Astfel, PrP Sc este o moleculă proteică, care se auto-propagă [5-7].

Deoarece PrP Sc este rezistent la denaturarea termică la 121 ° C și la numeroase metode de decontaminare chimică, inactivarea PrP Sc este o țintă importantă de cercetare cu obiectivul prevenirii EST. Organizația Mondială a Sănătății recomandă o combinație de curățare, tratament chimic și sterilizare termică a echipamentelor medicale [8]. Mai precis, liniile directoare recomandă utilizarea unei autoclave și a unor tratamente chimice puternice, cum ar fi hidroxid de sodiu cu concentrație ridicată sau hipoclorit de sodiu, pentru instrumentele refolosibile. Deși aceste proceduri sunt eficiente pentru eliminarea infectivității, unele instrumente chirurgicale și complexe, cum ar fi endoscoapele cu fibră optică, nu pot fi decontaminate folosind aceste metode, deoarece ar putea fi deteriorate [9]. În plus, riscurile de siguranță asociate cu utilizarea substanțelor chimice puternice sunt de interes pentru comunitatea medicală [10]. Prin urmare, sunt necesare proceduri de decontaminare a prionilor cu o potență suficientă și o siguranță îmbunătățită [11].

Materiale și metode

Pregătirea proteazelor

Proteinaza K (PK) a fost achiziționată de la Wako Pure Chemicals Ltd, Osaka, Japonia. Tk-subtilisina a fost preparată din E. coli recombinant BL21 (DE3) adăpostind vectorul de expresie a genei Tk-subtilisină, așa cum sa descris anterior [14,17].

Pregătirea omogenizării creierului șoarecelui și Western blot

Omogenizarea creierului șoarecilor bolnavi terminal infectați cu tulpina Chandler de prion scrapie (SBH) a fost preparată la 10% (greutate/volum) în PBS steril. Concentrația de proteine ​​a omogenatului a fost măsurată folosind un kit de testare a proteinelor DC (BioRad). Pentru a pregăti proba pentru degradarea PrP, o cantitate adecvată de omogenat, echivalentă cu 60 μg de proteină, a fost amestecată cu 0,5 M Tris-HCI (pH 8,0) și concentrațiile necesare de Tk-subtilisină și apă distilată, astfel încât totalul volumul a fost de 50 μL pentru fiecare afecțiune. S-a adăugat dodecil sulfat de sodiu (SDS) la 3% (greutate/volum), după cum este necesar. Probele rezultate au fost incubate la 100 ° C pentru timpul specificat. Când a fost necesară inactivarea Tk-subtilisinei, s-au adăugat 50 mM diisopropilfluorofosfat înainte de prepararea probei pentru electroforeza în gel de poliacrilamidă SDS (SDS-PAGE). A fost adăugat tampon de încărcare de două ori (150 mM Tris-HCI (pH 6,8), 6% (g/v) SDS, 30% (g/v) glicerol și 0,03% (g/v) albastru de bromofenol) și probele au fost fierte timp de 5 min. SDS-PAGE a fost efectuat folosind un gel de poliacrilamidă 15%, iar PrP a fost detectat prin Western Blot cu un anticorp anti-PrP, SAF83 (SPI bio, Montigny le Bretonneux, Franța).

Bio-test de infectivitate

Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare pentru experimentele pe animale ale Școlii de Științe ale Sănătății, Facultatea de Medicină, Universitatea Ryukyus.

O suspensie de 10% g/v de SBH de la șoareci infectați cu tulpina Chandler a fost utilizată pentru a testa efectul degradării Tk-subtilisinei sau a tratamentului SDS asupra infectivității PrP Sc. Suspensia de 10% SBH a fost diluată la 1% cu tampon Tris-HCI 200 mM (pH 8,0). La fiecare alicot din SBH s-au adăugat fie 2,0 μg/ml de Txubtilisină, fie 1% SDS sau ambele. SBH fără Tk-subtilizină și SDS a fost preparat ca control. Fiecare alicotă a fost incubată la 100 ° C timp de 60 de minute pentru a inactiva PrP Sc. Fiecare alicotă rezultată a fost inoculată intracerebral la șoareci masculi C57BL6/JJmsSlc de 11 săptămâni. Un total de 20 pl de suspensie SBH 1% a fost injectat în sistemul ventricular cerebral al șoarecilor folosind o micro-seringă. Șase șoareci din fiecare grup de inoculare au fost examinați pentru perioada indicată.

Imunohistochimie

Rezultate

Așa cum s-a arătat în studiul nostru anterior [14], PrP Sc în creierul omogenizat de la șoareci infectați cu scrapie a fost degradat de o protează hipertermofilă, Tk-subtilisin, la niveluri nedetectabile prin western blot. Rezultatele arată că 2,0 μg/mL de Tk-subtilisină poate degrada PrP la un nivel nedetectabil prin western blot. Cu toate acestea, nu se știa dacă PrP Sc degradat și-a pierdut infectivitatea. Pentru a clarifica acest lucru, infecțiozitatea SBH tratată cu Tk-subtilisină în diferite condiții a fost evaluată folosind un test biologic. În total, șase grupuri de șoareci au fost supuși unor inoculanți diferiți, așa cum se arată în tabelul 1. Simptomele clinice și pierderea în greutate pentru fiecare șoarece din fiecare grup au fost observate până când au murit sau până la 453 de zile după inoculare.

Inoculul N/N0 a Rata de supravietuire (%) Timpul mediu de supraviețuire (zile)
Apă distilată sterilizată 0/6 100 > 453
1% SBH fără tratament termic 4/4 0 168,5
1% SBH * 6/6 0 255,7
1% SBH * + 2 μg/mL Tk-subtilisină 6/6 0 262,7
1% SBH * + 1% SDS 1/6 83.3 > 420
1% SBH * + 2 μg/mL Tk-subtilizină + 1% SDS 0/6 100 > 453

a N/N0, numărul de șoareci care au dezvoltat infecție pe numărul de șoareci inoculați.
* Probele au fost tratate termic la 100 ° C timp de 1 oră.

Tabelul 1: Timpul de supraviețuire pentru șoarecii infectați cu scrapie (tulpina Chandler).

hipertermabile

Figura 1: Imagini micrografice ușoare ale creierului de șoarece (A, B) și splinei (C, D) 155 de zile după inoculare colorate cu hematoxilină și eozină. (A, B) Multe vacuole sunt observate în toate zonele creierului unui șoarece infectat cu scrapie (vârfuri de săgeți), în timp ce nu se observă vacuole în creierul unui șoarece neinfectat. (C, D) Nodulii limfatici care conțin centrul germinal (asterisc) sunt observați atât în ​​splina unui șoarece fără infectare, cât și a unui șoarece infectat cu scrapie. Centrul germinal al unui șoarece infectat cu scrapie este difuz de mare, sugerând un răspuns imun la infecție. Bare = 100 μm.

Figura 2: Imagini micrografice ușoare ale creierului de șoarece (A-F) și splinei (G-L) 155 de zile după inoculare. (AF) Vacuolarea neuropilă este observată în toate zonele creierului unui (B) șoarece infectat cu scrapie (vârfuri de săgeți), în timp ce nu se observă vacuolare în creierul unui (A) un șoarece neinfectat, (C) un șoarece inoculat cu SBH incubat la 100 ° C, (D) un șoarece inoculat cu SBH incubat la 100 ° C cu 1% SDS, (E) un șoarece inoculat cu SBH digerat cu Tk-subtilisină și (F) un șoarece inoculat cu SBH incubat cu Tk-subtilizină și 1% SDS. (GL) Imagini micrografice ușoare care arată localizarea PrP în splina (G) unui șoarece neinfectat, (H) un șoarece infectat cu scrapie, (I) un șoarece inoculat cu SBH incubat la 100 ° C, (J) un șoarece inoculat cu SBH incubat la 100 ° C cu 1% SDS, (K) un șoarece inoculat cu SBH digerat cu Tk-subtilisină și (L) un șoarece inoculat cu SBH incubat cu Tk-subtilisină și 1% SDS. Imunoreactivitatea pentru PrP (semnal maro) este detectată în jurul centrului nodulului limfatic în splina (H) unui șoarece infectat cu scrapie, (I) un șoarece inoculat cu SBH incubat la 100 ° C și (K) un șoarece inoculat cu SBH digerat cu Tksubtilisin. Nu se observă marcarea PrP la nodulii limfatici (G, J, L). Bare: A-F = 100 μm; G-L = 50 μm.

Discuţie

Pe baza rezultatelor, concluzionăm că SBH tratat cu Tk-subtilisină își menține infectivitatea, în ciuda faptului că analiza western blot nu a arătat niciun semnal PrP. Este posibil ca Tk-subtilisina să degradeze regiunea epitopului PrP Sc, dar părțile nedigerate ale PrP Sc să rămână la fel de infecțioase ca și proteina nativă. Cu toate acestea, un rezultat similar a fost observat atunci când un alt anticorp anti-PrP, SAF32, a fost utilizat pentru analiza Western blot (datele nu sunt prezentate). Epitopul SAF83 este resturile de aminoacizi 142-160 din PrP, în timp ce cel al SAF32 este resturile 51-91. Cealaltă posibilitate este că degradarea PrP Sc este cantitativ insuficientă pentru a elimina infectivitatea, chiar dacă nu poate fi detectată prin analiza western blot. Sunt necesare alte experimente pentru a investiga motivele potențiale ale infectivității PrP Sc după digestia Tk-subtilisinei.

În plus, este probabil ca SDS să joace un rol important în degradarea PrP Sc de Tk-subtilisin. SBH include multe substanțe biogene, cum ar fi acizii nucleici și acizii grași, despre care se crede că interacționează cu PrP Sc [18] și este probabil să interfereze cu interacțiunea dintre Tk-subtilisin și PrP Sc. Mai mult, PrP Sc este cunoscut pentru a forma oligomeri și particule insolubile. Aceste caracteristici pot împiedica proteoliza PrP Sc în SBH. Deoarece se presupune că SDS funcționează, permițând Tksubtilisinului să acceseze particulele insolubile de PrP Sc, este posibil ca prezența SDS să permită Tk-subtilisinului să degradeze nucleul infecțios al PrP Sc, care nu poate fi realizat doar de Tk-subtilisin.

Din rezultatele bioanalizei (tabelul 1), este clar că tratamentul SDS reduce semnificativ infectivitatea SBH, probabil prin denaturarea PrP Sc în SBH. Cu toate acestea, după cum arată rezultatele testului de supraviețuire, pierderea de infectivitate nu este completă. Cu toate acestea, tratarea SBH atât cu Tk-subtilisină, cât și cu SDS scade infectivitatea SBH mai eficient decât SDS singur ca urmare a efectului cooperativ al denaturării prin SDS și degradării de către Tk-subtilisin. Astfel, Tk-subtilisina poate fi un ingredient util de inclus în reactivi concepuți pentru decontaminarea PrP Sc. Pentru a testa această cooperare aparentă, este necesară o analiză cantitativă suplimentară a degradării Tk-subtilizinei PrP Sc.

Procedurile eficiente de decontaminare pentru PrP Sc în domeniul medical sunt de mare importanță. Utilizarea unui protează ca ingredient în detergenții medicali este o opțiune foarte atractivă pentru stabilirea unei proceduri simple de decontaminare a prionilor. Este necesară o evaluare cantitativă suplimentară a efectelor Tk-subtilisinei asupra infectivității PrP Sc în condiții mai puțin stricte.

Mulțumiri

Autorii doresc să-l recunoască pe Dr. Kazuyoshi Ikuta, profesor al Fundației de Cercetare pentru Boli Microbiene a Universității din Osaka, pentru ajutorul său în interpretarea semnificației rezultatelor acestui studiu. Această lucrare a fost susținută parțial de o subvenție de la Senri Life Science Foundation, Japonia, de către Ministerul Sănătății, Muncii și Bunăstării, Japonia, și de un program de subvenționare a cercetării tehnologiei industriale de la New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO) din Japonia. Autorii nu au conflicte de interese de declarat.