Abstract

Declarație de semnificație

Există o nevoie urgentă de terapie pentru a îmbunătăți rezultatele pentru pacienții cu neurotraumatism. Aici testăm efectele unei terapii dietetice neinvazive. Dietele cetogenice, cu conținut ridicat de grăsimi și cu conținut scăzut de carbohidrați, s-au dovedit a fi eficiente în tratarea epilepsiei și a bolii Parkinson și prezintă promisiuni pentru tratarea altor neurotraumatisme și afecțiuni neurodegenerative. Aici arătăm că, deși am reușit să producem concentrații mari de cetonă la șoareci, efectele asupra recuperării funcției și durerii în urma unei hemisecții toracice a măduvei spinării sau a unei leziuni nervoase menajere au fost minime. Prin urmare, dietele ketogene, deși eficiente în anumite cazuri, ar trebui evaluate în funcție de tipul de leziune.

diete

Introducere

Leziunile nervoase ale SNC și ale sistemului nervos periferic cuprind un grup eterogen de afecțiuni care provoacă dizabilități semnificative și, de asemenea, au caracteristici comune. Există mai multe cauze subiacente care contribuie la leziuni ale nervilor periferici și leziuni ale măduvei spinării (SCI), cum ar fi neurotrauma, demielinizarea și tulburările autoimune (Ahuja și Fehlings, 2016). Pe lângă tulburările de mișcare, pacienții cu leziuni neuronale au incidențe mari de durere persistentă. Datele epidemiologice sugerează că 53% dintre pacienții cu SCI suferă de durere (Burke și colab., 2017), prevalența globală a durerii neuropatice (adică durerea ca urmare a leziunilor nervoase) estimată la 7% (van Hecke și colab., 2014 ). Mai important, durerea persistentă inhibă pacienții să adere la terapiile de reabilitare (Turk și Rudy, 1991); astfel, durerea și pierderea funcțiilor motorii formează o buclă de feedback negativ care perpetuează în continuare dizabilitățile (Thompson și colab., 2016).

Pentru pacienții cu leziuni nervoase, îmbunătățirea funcțiilor motorii și reducerea durerii cronice sunt importante pentru calitatea vieții (Adams și Hicks, 2005; Jensen și colab., 2007). Cu toate acestea, există puține terapii pentru a viza atât durerea, cât și funcțiile motorii simultan, în parte din cauza diversității etiologiilor și a progresului bolii. Majoritatea terapiilor care vizează neurodegenerarea și durerea sunt simptomatice și nu fac prea mult pentru a opri pierderea funcțională (Scholz și colab., 2009). Terapiile de durere existente, inclusiv gabapentina și opioidele, au toate efecte secundare (Teasell și colab., 2010), dezvoltarea toleranței și dependenței împiedicând succesul tratamentului. În general, pacienții se bazează pe terapii combinatorii, necesitând mai multe tipuri de medicamente și gestionare, rezultând astfel rate de optimizare a respectării prescripțiilor lor. Identificarea unei terapii mai cuprinzătoare care vizează tulburările de durere și mișcare este urgent necesară pentru îmbunătățirea îngrijirii leziunilor nervoase (Simpson și colab., 2012; Teasell și colab., 2010).

O caracteristică cheie a leziunii nervoase este neuroplasticitatea, care se manifestă în general ca modificări ale excitabilității neuronale și poate ajuta la recuperarea spontană, permițând încolțirea fibrelor neuronale care întăresc căile reflexe și propriospinale (Bareyre și colab., 2004; Finnerup și Baastrup, 2012). Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza neuroplasticității pot avea un impact negativ asupra durerii și spasticității (Brown și Weaver, 2012) atunci când apare sinaptogeneza dezadaptativă. Modificările nivelurilor neuromodulatorilor, incluzând serotonina, dopamina și noradrenalina, sunt facilități cruciale ale neuroplasticității (Azmitia, 1999; Nitsche și colab., 2006; Marzo și colab., 2009). Important, fiecare dintre acești neuromodulatori se angajează în diverse funcții fiziologice, inclusiv cognitivă, reglarea dispoziției, mișcarea și somatosensarea; potențialul terapeutic în direcționarea acestor sisteme neuromodulatoare este împiedicat de rolurile lor fiziologice diverse.

Studiul actual explorează potențialul terapeutic al KD în reglarea disfuncțiilor motorii și ale durerii în leziunile nervoase. La șoarecii C57BL/6, două dintre cele mai frecvente modele de leziuni nervoase, inclusiv o hemisecție toracică (SCI) și leziunea nervoasă economisită (SNI), au fost efectuate pentru a imita leziunea SNC și, respectiv, a sistemului nervos periferic. O serie de teste comportamentale senzoriale și motorii au fost efectuate înainte și după leziuni pentru a testa efectele inițiale și postjudiciare ale KD. Nivelurile de neuromodulatori au fost comparate între șoareci hrăniți cu chow standard și KD.

Materiale și metode

Toate animalele utilizate au fost șoareci masculi C57/BL6 între 8 și 16 săptămâni în timpul testării. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de comitetul de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Calgary și sunt catalogate conform protocolului AC15-0026.

Administrarea dietei ketogenice

Următoarele două diete standard au fost utilizate cu animalele din acest studiu și li s-au dat ad libitum: dieta cu pelete (PD) și 6: 1 KD. Toate animalele au fost inițial hrănite cu o dietă standard pentru pelete ad libitum [Pico-Vac Mouse Diet 20 (Lot 5062), LabDiet] dat în suportul de alimentare suspendat al cuștilor. Animalele KD au fost postite 1 seară (12 ore), cu o săptămână înainte de testare și li s-au administrat zilnic ~ 15 g de chow congelat KD (catalog nr. S3666, Bio-Serv) pentru a se asigura că nivelurile cetonice din sânge au fost peste pragul cetozei (Smith et. al., 2016). Compoziția nutrițională și nivelurile de macronutrienți sunt enumerate în Tabelul 1.

Compoziția nutrițională a dietelor administrate

Prelevarea de sânge cetonică

Concentrațiile de cetonă din sânge au fost prelevate cu ajutorul extragerilor de sânge din coadă. Aproximativ 1,5-2 µl au fost extrase făcând o tăietură superficială de ± 1 mm de la capătul cozii folosind o lamă de bisturiu # 10 (catalog # 10 010–00, Fine Science Tools). Sângele a fost masat din coadă, iar acesta a fost testat folosind un monitor de sânge cetonic (Freestyle Precision Neo, Abbott Laboratories) și benzi de testare a ceto-ului (bandă de testare Abbott β-cetonă, Abbott Laboratories). Toate valorile au fost înregistrate în software pentru analize offline.

Colectarea țesutului HPLC

Într-o cohortă de 26 de animale, șoarecii au fost randomizați și codificați înainte de a fi sacrificați după 28 de zile de cetoză. Animalele KD au suferit paradigma standard a dietei KD, așa cum s-a subliniat mai sus. În ziua colectării țesuturilor, animalele au fost sacrificate folosind doze mari de izofluran (5%) într-o cameră de inducție. Coloana vertebrală a fost extrasă prin tăierea nivelurilor sacrum și vertebrale cervicale folosind foarfece mari. Măduva spinării a fost extrasă folosind o seringă de 10 ml încărcată cu aCSF cu presiune de fluid inițiată în regiunea lombară. Măduva spinării a fost tăiată pentru a conține doar mărirea lombară (L1 - L6), iar măduva spinării a fost înghețată rapid în azot lichid. Măduva spinării a fost analizată pentru amine biogene prin modificări ale unei metode raportate anterior (Parent și colab., 2001). Țesutul a fost omogenizat în acid percloric 0.1N răcit cu gheață conținând EDTA (10 mg%) și acid ascorbic (50 μm). Omogenatul a fost centrifugat și 10 ofl de supernatant au fost utilizate în testul HPLC folosind o coloană Atlantis dC18 (Waters) și un detector electrochimic.

Intervenție chirurgicală

Toate procedurile chirurgicale au fost efectuate folosind tehnici aseptice sub anestezie cu izofluran între 1% și 2% administrat cu 0,4 L/min de oxigen de calitate medicală (100% oxigen; Vitalair 1072, Hosokawa). Zona de intervenție chirurgicală a fost rasă folosind foarfece de animale, curățată cu soluție de betadină 5% și sterilizată cu etanol 95%.

Leziune nervoasă distinsă

Odată anesteziat și pregătit, a fost făcută o tăietură superficială de 1 cm în coada posterioară stângă a pielii deasupra liniei mediane a femurului, deasupra articulației genunchiului până la articulația șoldului. Pielea a fost resecată din fascia prin disecție contondentă pentru a vizualiza în mod corespunzător musculatura surelor tricepsului și a bicepsului femural. Mușchii erau separați de-a lungul locului în care se intersectează ambii. Nervul sciatic a fost izolat între trifurcarea nervului peroneal comun (CP)/Tibial (Tib) și a nervului sural cu fascia înconjurătoare îndepărtată. Atât CP, cât și Tib au fost ligate folosind o sutură de 6-0 (catalog # 18 020-60, Fine Science Tools). Nervii au fost apoi tăiați pe capătul distal al suturii pentru a crea o tranziție completă atât a Tib cât și a CP, lăsând în același timp nervul sural intact. Pentru procedurile simulate, nervii au fost expuși și identificați, dar au fost lăsați intacti. Plăgile deschise și musculatura au fost suturate folosind o sutură dizolvabilă de 4-0 într-un mod întrerupt cu adeziv tisular (Vetbond, 3M) pe piele și suturi pentru a asigura nodurile. Procedurile SNI au fost verificate în timpul intervențiilor chirurgicale și post-hoc.

Leziuni ale măduvei spinării

Testarea comportamentului și a durerii

Randomizare

Toate experimentele au fost randomizate și orbite. Randomizarea a fost efectuată folosind un generator de numere aleatorii (www.random.org) în fiecare zi de experimentare pentru a se asigura că animalele nu au fost obișnuite cu cutii sau poziții specifice în teste. Animalele au fost testate în cohorte de 12, împărțite în următoarele trei grupe: SHAM, Injury + PD și Injury + KD. Toate animalele din fiecare cohortă au primit un număr de referință între 1 și 12. În zilele de testare, generatorul de numere aleatorii a furnizat o matrice 2 × 6 de numere alocate aleatoriu între 1 și 12, care indică fie poziția plasării în aparatul de testare, fie ordinea în care a fost testat un animal. Această metodă a asigurat faptul că animalele nu erau obișnuite nici la locația specifică din aparatele de testare, nici la ora din zi în care a fost efectuată testarea.

von Frey

Alodinia mecanică a fost evaluată prin măsurarea pragului de retragere a labelor din spate la firele de păr von Frey (vFhs). Animalele au fost plasate individual în camere de testare a plexiglasului pe o suprafață de plasă ridicată pentru a permite accesul la picioarele posterioare și au fost obișnuite timp de 30 de minute înainte de testare. Sensibilitatea mecanică de bază a fost determinată pentru fiecare animal înainte de leziuni. S-a utilizat o gamă de vFh (0,2-2 g), s-a înregistrat prezența sau absența unui răspuns de retragere, iar pragul de retragere a fost calculat folosind metoda ascendentă a Dixon (Chaplan și colab., 1994).

Test de câmp deschis

Pentru testele în câmp deschis (OFT), animalele au fost obișnuite în cameră timp de 1 oră înainte de administrarea testelor. Animalele au fost plasate în cutii de câmp deschis (Cleversys Systems) câte patru cutii pe rând. Protocolul de câmp deschis a fost setat pentru 30 de minute de la momentul inserării în arenă. Centrul casetei a fost definit de 25% din dimensiunea arenei totale din centrul casetei. Periferia a fost definită ca aria totală a cutiei minus zona centrală și acoperă periferia din jurul centrului până la pereții câmpului deschis.

Scară treptată