Stephanie Matyi

1 Departamentul de Medicină Geriatrică, Universitatea din Oklahoma Centrul de Științe ale Sănătății, Oklahoma City, OK SUA

2 Reynolds Oklahoma Center on Aging, Oklahoma City, OK SUA

Jordan Jackson

1 Departamentul de Medicină Geriatrică, Universitatea din Oklahoma Centrul de Științe ale Sănătății, Oklahoma City, OK SUA

2 Reynolds Oklahoma Center on Aging, Oklahoma City, OK SUA

Karla Garrett

1 Departamentul de Medicină Geriatrică, Universitatea din Oklahoma Centrul de Științe ale Sănătății, Oklahoma City, OK SUA

2 Reynolds Oklahoma Center on Aging, Oklahoma City, OK SUA

Sathyaseelan S. Deepa

1 Departamentul de Medicină Geriatrică, Universitatea din Oklahoma Centrul de Științe ale Sănătății, Oklahoma City, OK SUA

2 Reynolds Oklahoma Center on Aging, Oklahoma City, OK SUA

Archana Unnikrishnan

1 Departamentul de Medicină Geriatrică, Universitatea din Oklahoma Centrul de Științe ale Sănătății, Oklahoma City, OK SUA

2 Reynolds Oklahoma Center on Aging, Oklahoma City, OK SUA

3 Harold Hamm Diabetic Center, Oklahoma City, OK SUA

Abstract

În ultimii 50 de ani, restricția dietetică (DR) s-a dovedit a prelungi durata de viață a unei largi varietăți de organisme. O caracteristică distinctivă a DR este homeostazia îmbunătățită a glucozei, rezultând o toleranță crescută la glucoză și sensibilitatea la insulină a animalelor, de la rozătoare la oameni. În acest studiu, am demonstrat efectele timpurii ale diferitelor niveluri de DR asupra toleranței la glucoză. În 10 zile de 40% DR, toleranța la glucoză a fost semnificativ îmbunătățită și cu 120 de zile; 10 și 20% DR au prezentat, de asemenea, o toleranță crescută la glucoză. Toate cele trei niveluri de DR au arătat adipozitate redusă, expresie crescută a genelor implicate în rotația grăsimilor și o reducere a expresiei pentru markerii inflamației. Studiile au arătat că șoarecii hrăniți cu o dietă DR au păstrat memoria metabolică în ceea ce privește toleranța îmbunătățită la glucoză chiar și după întreruperea DR. Arătăm că 40% DR nu numai că are un efect timpuriu asupra toleranței la glucoză, ci și-l menține după ce DR a fost întrerupt timp de 2 luni. Prin urmare, îmbunătățirea toleranței la glucoză este adusă de toate cele trei niveluri de DR, dar memoria metabolică nu este receptivă la doză.

Introducere

Prima și cea mai studiată manipulare care arată că crește durata de viață la mamifere este restricția dietetică/calorică. S-a demonstrat că restricția dietetică (DR) crește mai întâi durata de viață a șobolanilor și, ulterior, diferite tulpini de șoareci. Cercetările din ultimele două decenii arată că DR crește durata de viață a unei largi varietăți de alte organisme, de la nevertebrate, cum ar fi drojdia, C. elegans și Drosophila, precum și păianjeni și rotifere la diferite tulpini de șobolani și șoareci (Weindruch și Walford 1988; Swindell 2012). De asemenea, s-a raportat că DR crește durata de viață a altor tipuri de mamifere, cum ar fi Labrador Retrievers (Kealy și colab. 2002) și maimuțele Rhesus (Colman și colab. 2009).

Dieta standard DR care este utilizată în majoritatea studiilor cu șobolani și șoareci este de 40% DR, în care rozătoarele sunt hrănite cu 60% din dieta consumată de animalele hrănite ad libitum (AL). În general, se crede că creșterea nivelului de restricție duce la o creștere mai mare a duratei de viață până la un punct (aproximativ 60% DR) și în care restricțiile suplimentare sunt dăunătoare (Weindruch și colab. 1986; Clancy și colab. 2001). De exemplu, Weindruch și colab. (1986) au raportat că o creștere semnificativă (peste 20%) a supraviețuirii medii a avut loc între

55% DR pentru șoareci femele C3B10RF1. Cu toate acestea, două studii recente sugerează că nivelurile mai scăzute de DR sunt la fel de eficiente în creșterea duratei de viață ca 40% DR. Grupul nostru a arătat că 10% DR a crescut semnificativ durata de viață a șobolanilor F344 la un nivel similar cu creșterea duratei de viață observată cu 40% DR (Richardson și colab. 2016). În plus, Mitchell și colab. (2016) au arătat că 20% DR a fost la fel de eficient și, în unele cazuri, mai eficient decât 40% DR, la creșterea duratei de viață la șoarecii C57BL/6 și DBA/2.

Scopul experimentelor descrise mai jos a fost de a determina cât de repede diferitele niveluri de DR (10, 20 și 40%) îmbunătățesc toleranța la glucoză. Am observat că în 10 zile de 40% DR, toleranța la glucoză a fost semnificativ îmbunătățită și, la 4 luni, șoarecii hrăniți cu 10 și 20% DR au avut o îmbunătățire similară a toleranței la glucoză ca 40% DR. De asemenea, am observat că 40% DR pe termen scurt (4 luni) conferă șoareci o memorie metabolică atunci când au fost trecuți la hrănirea AL, ceea ce nu a fost observat la șoarecii hrăniți cu 10 și 20% DR.

Metode

Animale și dietă

Compozitia corpului

Compoziția corporală a animalelor a fost măsurată utilizând spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (RMN-Bruker minispec) după DR și la 2 luni după trecerea la alimentarea cu AL. Au fost măsurate grăsimea corporală și masa corporală slabă a animalelor din fiecare grup.

PCR în timp real

Nivelurile transcrierilor specifice ARN mesager (ARNm) ale genelor implicate în inflamație, metabolismul acizilor grași și diferențierea adipocitelor au fost măsurate prin PCR în timp real în țesuturile adipoase albe epididimale și subcutanate de la șoareci DR și AL la 4 luni după inițierea DR (n = 5 per grup). Pe scurt, ARN a fost izolat folosind RNeasy Kit de la Qiagen (Germantown, MD, SUA). ADNc din prima catenă a fost sintetizat din 1 μg ARN folosind primerii aleatori (Promega, Madison, WI, SUA) și purificat folosind QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Germantown, MD, SUA). Expresia genelor candidate a fost cuantificată utilizând PCR în timp real cu SYBR Green, iar secvențele de exemplu sunt date în Tabelul 1. 1. Transcrierile genei au fost normalizate la β-actină. Expresia relativă a genei a fost cuantificată ca analiză comparativă a Ct utilizând metoda de analiză 2 −ΔΔct cu β-actină ca control endogen. Proiectarea ANOVA unidirecțională cu corecția testului multiplu a lui Tukey a fost utilizată pentru a analiza statistic probele individuale.

tabelul 1

Denumire genă Grund înainte Grund invers
Adiponectina5′-GCCGCTTATGTGTATCGCTCAG-3 ′5′-GCCAGTGCTGCCGTCATAATG-3 ′
Leptina5′-TGACACCAAAACCCTCATCA-3 ′5′-TCATTGGCTATCTGCAGCAC-3 ′
IL-65′-TGGTACTCCAGAAGACCAGAGG-3 ′5′-AACGATGATGCACTTGCAGA-3 ′
TNF-a5′-CACAGAAAGCATGATCCGCGACGT-3 ′5′-CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTTCT-3 ′
MCP-15′-CCACTCACCTGCTGCTACTCAT-3 ′5′-GGTGATCCTCTTGTAGCTCTCC-3 ′
FAS5′-GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3 ′5′-TGGGTAATCCATAGAGCCCAG-3 ′
ACC5′-GATGAACCATCTCCGTTGGC-3 ′5′-GACCCAATTATGAATCGGGAGTG-3 ′
CPT-15′-AAGGGTAGAGTGGGCAGAGG-3 ′5′-GCAGGAGATAAGGGTGAAAGA-3 ′
MCAD5′-CTAACCCAGATCCTAAAGTACCCG-3 ′5′-GGTGTCGGCTTCCAAATGA-3 ′
LCAD5′-CTTGCTTGGCATCAACATCGCAGA-3 ′5′-ATTGTAGTACGCTTGCTCTTCCCA-3 ′
PGC-1α5′-CCCTGCCATTGTTAAGACC-3 ′5′-TGCTGCTGTTCCTGTTTTC-3 ′
PPARy-25′-CGAGGACATCCAAGACAAC-3 ′5′-GTGCTCTGTGACGATCTG-3 ′
CEBP-α5′-CAAGAACAGCAACGAGTACCG-3 ′5′-GTCACTGGTCAACTCCAGCAC-3 ′
AP-25′-TAACCCTAGATGGCGGGGCCC-3 ′5′-AACACATTCCACCACCAGCTTGTC-3 ′
β-Actină5′-GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3 ′5′-AGATGGGCACAGTGTGGGTGA-3 ′

Test de toleranță la glucoză

Toleranța la glucoză a fost determinată după un post peste noapte de șoareci după 3, 10, 21 și 120 de zile de DR. Toleranța la glucoză a fost, de asemenea, determinată la șoarecii C57BL/6 cu restricție de 40% comutați la alimentarea cu AL (DR-AL) cu un n de 10 per grup. Șoarecii au fost cântăriți și injectați intraperitoneal cu 20% glucoză (2 g/kg), iar nivelurile de glucoză din sânge colectate din coadă au fost măsurate pe o perioadă de 120 de minute folosind un glucometru (Contour NEXT EZ, Bayer, Whippany, Germania). Zona sub curbă (ASC) pentru fiecare curbă a fost determinată și reprezentată ca ASC glucoză (mmol × 120 min).

Rezultate

Efectul diferitelor niveluri de DR asupra compoziției corpului

Studiile au arătat anterior că 40% DR reduce greutatea corporală și masa totală de grăsime a rozătoarelor de laborator (Barzilai și colab. 1998; Mitchell și colab. 2016). În acest studiu, am investigat efectul timpuriu al DR asupra greutății corporale și compoziției corporale a șoarecilor masculi C57BL/6 hrăniți cu trei niveluri de DR (10, 20 și 40% DR). Am inițiat DR la vârsta de 4 luni și am urmărit modificările greutății corporale și a compoziției peste 4 luni până la vârsta de 8 luni. Figura Figura 1 prezintă greutatea corporală și compoziția corporală a animalelor la 3, 10, 21, 60 și 120 de zile de DR. Șoarecii hrăniți cu 10 și 20% DR nu au prezentat modificări semnificative în greutatea corporală în comparație cu grupul AL în niciun moment de studiu (Fig. 1 a). Pe de altă parte, șoarecii din grupul de 40% DR au prezentat o scădere semnificativă a greutății corporale comparativ cu omologii lor AL începând cu 3 zile de DR. Șoarecii cu 40% DR au prezentat o scădere cu 10-15% a greutății corporale, care a fost menținută pe tot parcursul studiului de 4 luni (Fig. (Fig. 1a). 1 a). Masa totală de grăsime a scăzut semnificativ (

28%) la șoareci hrăniți cu 10 și 20% DR după 21 de zile de DR comparativ cu omologii lor AL (Fig. (Fig.1b). 1 b). Șoarecii hrăniți cu 40% DR au demonstrat o reducere semnificativ mai mare a masei totale de grăsime (

67%) începând cu 10 zile de DR (Fig. (Fig. 1b). 1 b). Masa corporală slabă a șoarecilor hrăniți cu 10 și 20% DR nu a prezentat nicio modificare semnificativă în comparație cu grupul AL; cu toate acestea, șoarecii hrăniți cu 40% DR au avut o scădere semnificativă (

20%) în masa corporală slabă începând cu 60 de zile de DR.

dietetică

O creștere de 66% și șoarecii hrăniți cu 20% DR au prezentat o

Creșterea cu 36% a raportului grăsimii subcutanate/epididimale datorită scăderii grăsimii epididimale și nicio modificare a grăsimii subcutanate în comparație cu șoarecii hrăniți cu AL. În schimb, șoarecii hrăniți cu 10% DR nu au prezentat nicio diferență semnificativă în raportul de grăsime subcutanată/epididimală comparativ cu șoarecii hrăniți cu AL după 4 luni de DR. Din nou, creșterea raportului de grăsime subcutanată/epididimală s-a datorat unei reduceri a grăsimii epididimale, fără nicio modificare semnificativă a grăsimii subcutanate. Datele noastre arată că efectul DR asupra raportului grăsimii subcutanate/epididimale variază în funcție de nivelul DR; prin urmare, cu cât este mai mare nivelul de DR, cu atât este mai mare scăderea grăsimii epididimale.

S-a demonstrat că 40% DR pe termen scurt crește markerii biogenezei mitocondriale (de exemplu, PGC-1α) în multe țesuturi la șoareci, inclusiv țesutul adipos alb (Nisoli și colab. 2005; Nisoli și colab. 2003; Larrouy și colab. 1999 Higami și colab., 2004). În studiul nostru, 40% DR a crescut semnificativ expresia PGC-1α cu

75% numai în grăsimea epididimală, dar nu și în grăsimea subcutanată (Fig. (Fig. 3d). 3 d). Pe de altă parte, 10 și 20% DR nu au avut un efect semnificativ asupra expresiei PGC-1α în grăsimile epididimale (Fig. (Fig.3d). 3 d). Spre deosebire de grăsimea epididimală, grăsimea subcutanată a prezentat o scădere semnificativă (

40-60%) în expresia PGC-1α pentru toate cele trei niveluri de DR (Fig. (Fig.3d). 3 d). În cele din urmă, am evaluat expresia genelor implicate în diferențierea adipocitelor (PPAR-γ, CEBP-α și AP-2). S-a demonstrat că adiponectina stimulează diferențierea adipocitelor (Fu și colab. 2005) și, în concordanță cu aceasta, 40% DR a arătat o creștere semnificativă a markerilor diferențierii adipocitelor atât în ​​grăsimea epididimală, cât și în cea subcutanată (Fig. (Fig. 3d), 3 d), ambele având, de asemenea, o creștere semnificativă a adiponectinei (Fig. (Fig. 3a). 3a). Grăsimea epididimală de la șoareci hrăniți cu 10% DR a arătat o creștere semnificativă a CEBP-α, dar nu a prezentat diferențe semnificative în expresiile PPARγ-2 și AP-2, în timp ce în grăsimea subcutanată, 10% DR nu a prezentat diferențe semnificative a genelor studiate (Fig. (Fig.3d). 3 d). În mod similar, 20% DR a arătat, de asemenea, doar o creștere semnificativă a CEBP-α în grăsimea epididimală, dar spre deosebire de 10% DR, 20% DR a crescut semnificativ PPARγ-2 și CEBP-α în grăsimea subcutanată (Fig. (Fig.3 3 d ).

Efectul diferitelor niveluri de DR asupra toleranței la glucoză

Analizele noastre de expresie genică a ambelor depozite de grăsime arată reglarea diferențiată a diferiților markeri de inflamație, metabolismul acizilor grași, biogeneza mitocondrială și diferențierea adipocitelor între cele trei niveluri ale DR, care ar putea juca un rol în sensibilitatea la insulină. Datele provenite de la rozătoare de laborator și primate neumane au arătat că 40% DR reduce în mod constant nivelul glicemiei (Masoro și colab. 1992; McCarter și colab. 2007; Gresl și colab. 2001). Mai mult, s-a demonstrat anterior că DR (40%) îmbunătățește toleranța la glucoză la modelele de rozătoare de laborator (Escriva și colab. 2007; Cameron și colab. 2012; Selman și Hempenstall 2012; Mitchell și colab. 2016); prin urmare, în acest studiu, am analizat efectul cursului de timp al tuturor celor trei niveluri de DR asupra toleranței la glucoză. Figura Figura 4 prezintă zona de sub curbe pentru șoareci masculi C57BL/6 hrăniți cu AL și trei niveluri de DR (10, 20 și 40%). Este evident din Fig. 4 că 40% DR are un efect dramatic asupra toleranței la glucoză. În decurs de 10 zile de la 40% DR, toleranța la glucoză a fost semnificativ îmbunătățită (

20%). Șoarecii hrăniți cu 40% DR timp de 21 de zile au arătat o îmbunătățire suplimentară a toleranței la glucoză

27% și cu 120 de zile de DR, toleranța la glucoză a fost îmbunătățită

40% comparativ cu șoarecii hrăniți cu AL. Astfel, 40% DR îmbunătățește semnificativ toleranța la glucoză în decurs de 10 zile de la implementare, iar toleranța la glucoză s-a îmbunătățit constant pentru restul studiului (Fig. (Fig. 4). 4). Așa cum se arată în FIG. 4, 10 și 20% DR nu au prezentat nicio modificare semnificativă a toleranței la glucoză până la 120 de zile de DR, moment în care 10 și 20% DR au prezentat îmbunătățiri (24 și, respectiv, 36%) ale toleranței la glucoză comparativ cu omologii AL. La 120 de zile de DR, toleranța la glucoză nu a fost semnificativ diferită pentru șoarecii hrăniți cu 10, 20 sau 40% DR. Astfel, în timp ce cinetica îmbunătățirii toleranței la glucoză variază în funcție de nivelul de DR, se pare că se obține un nivel similar de îmbunătățire în termen de 120 de zile.