Abstract

OBIECTIV- Lipina 1 joacă roluri critice în controlul metabolismului energetic. Am căutat să determinăm expresia izoformelor lipinei 1 (lipina 1α și -β) în ficat și țesutul adipos al subiecților obezi și să evaluăm mecanismele celulare implicate în reglarea expresiei lipinei 1 prin stimuli fiziologici.

exprimarea

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE— Expresia lipinei 1α și -β a fost cuantificată în ficatul și țesutul adipos al subiecților umani extrem de obezi (IMC mediu 60,8 kg/m2) supuși unei intervenții chirurgicale de by-pass gastric (GBS). În al doilea rând, expresia lipinei 1 a fost evaluată în celulele HepG2 ca răspuns la supraexprimarea proliferatorului peroxizomului - receptor activat γ coactivator (PGC) -1α în condiții normale sau hiperinsulinemice.

REZULTATE— Exprimarea lipinei 1β în ficat și țesutul adipos a fost invers legată de IMC, concentrația plasmatică de insulină în repaus și evaluarea modelului de homeostazie a rezistenței la insulină, dar a fost semnificativ crescută prin scăderea în greutate marcată și sensibilizarea la insulină după GBS. Nivelurile de mARN ale lipinei hepatice 1β au fost puternic corelate cu expresia PGC-1α și supraexprimarea PGC-1α în celulele HepG2 a crescut expresia lipinei 1. În schimb, condițiile de cultură hiperinsulinemică au reglementat în jos expresia lipinei 1β, PGC-1α și a genelor lor țintă cunoscute implicate în metabolismul mitocondrial în celulele HepG2. În cele din urmă, supraexprimarea lipinei 1β sau PGC-1α a inversat efectul hiperinsulinemiei asupra expresiei genelor lor țintă.

CONCLUZII— Aceste studii sugerează că expresia lipinei hepatice 1β și PGC-1α este subregulată de obezitate și perturbări metabolice legate de obezitate la subiecți umani, probabil din cauza modificărilor concentrației sau sensibilității la insulină.

  • GBS, operație de by-pass gastric
  • HOMA-IR, evaluarea modelului de homeostazie a rezistenței la insulină
  • MCAD, acil-CoA dehidrogenază cu lanț mediu
  • PAP, acid fosfatidic fosfohidrolază
  • PGC, proliferator de peroxizom - receptor activat-γ coactivator
  • PPAR, proliferator de peroxizom - receptor activat
  • SDHA, subunitatea succinat dehidrogenază a

Gena care codifică lipina 1 (Lpin1) a fost descoperită utilizând o abordare de clonare pozițională pentru a localiza mutația cauzală la șoarecii distrofici (fld) ai ficatului gras. Șoarecii Fld lipsesc complet de lipina 1 și prezintă steatoză hepatică neonatală care se rezolvă spontan la scurt timp după înțărcare, lipodistrofie de-a lungul vieții și rezistență la insulină (1-3). Pe baza unei asemănări puternice a secvenței în domeniile terminale NH2- și COOH-terminale, a fost identificată o familie de proteine ​​lipinice (lipina 1, 2 și 3) în organismele superioare (1). În plus, îmbinarea alternativă a transcripției lipinei 1 generează două forme de proteină lipină 1, care sunt desemnate ca lipină 1α și lipină 1β (4,5). Exonul îmbinat alternativ în transcrierea lipinei 1β codifică 33 de aminoacizi suplimentari (Fig. 1A) fără omologie la alți membri ai familiei lipinelor.

Datele din modele de drojdie și vertebrate sugerează că proteinele lipinice au funcții nucleare și non-nucleare importante care reglează metabolismul lipidic și energetic. În citosol, proteinele lipinice prezintă activitate sub formă de acid fosfatidic fosfohidrolază (PAP) (6-8), enzima care catalizează penultima etapă în sinteza trigliceridelor. În nucleu, lipinele de drojdie și vertebrate sunt asociate cu cromatina și interacționează cu factori de transcripție pe mai mulți promotori de gene (9,10). La vertebrate, cei mai bine caracterizați parteneri ai factorului de transcripție ai lipinei 1 sunt familia proliferatorului peroxizomului - receptor activat (PPAR) (10). De asemenea, a fost detectată o interacțiune directă proteină-proteină între lipina 1 și o importantă proteină coactivator PPAR (PGC-1α). Mai mult, expresia genei lipinei 1 este indusă în mod robust de PGC-1α ca răspuns la mai mulți stimuli fiziologici din ficatul șoarecelui (10). Colectiv, datele disponibile sugerează că lipina 1 este o enzimă extrem de inductibilă implicată în metabolismul trigliceridelor și un regulator transcripțional care acționează într-un mod feed-forward pentru a coactiva complexul hepatic PGC-1α - PPARα pentru a crește capacitatea de catabolism a acizilor grași (10). ).

Lipina 1 este, de asemenea, o țintă din aval a cascadei de semnalizare a insulinei. Proteina Lipin 1 este fosforilată la mai multe reziduuri de serină și treonină după stimularea insulinei (4,8). În plus, exprimarea lipinei 1 din țesutul adipos este invers corelată cu IMC și rezistența la insulină (11-13). Aceste date sugerează o relație unică între adipozitatea, rezistența la insulină și activitatea lipinei 1 în țesutul adipos, un țesut cheie implicat în fiziopatologia metabolică a obezității. Ficatul este un alt organ puternic afectat de obezitate și rezistența la insulină. Cu toate acestea, din cunoștințele noastre, niciun studiu nu a evaluat relația dintre obezitate, rezistența la insulină și expresia hepatică a lipinei 1.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Douăzeci și șapte de bărbați extrem de obezi (n = 7) și femei (n = 20) supuși unei intervenții chirurgicale de bypass gastric (GBS) la Spitalul Barnes-Jewish au participat la acest studiu (tabelul suplimentar 1 [disponibil într-un apendice online la http: // dx .doi.org/10.2337/db07-0480]). Înainte de operație, toți subiecții au efectuat o evaluare medicală, inclusiv un istoric și examinare fizică și teste de sânge de rutină. Subiecții au fost excluși dacă au avut antecedente sau dovezi ale unei boli hepatice, altele decât boli hepatice nealcoolice, au consumat ≥20 g alcool/zi, au avut hipertrigliceridemie severă (≥200 mg/dl) sau au luat medicamente despre care se știe că provoacă steatoză hepatică sau leziuni hepatice. Deși niciun subiect nu a avut antecedente de diabet, diabetul a fost diagnosticat la 13 subiecți în timpul screeningului pre-chirurgical. Acești subiecți nu au luat medicamente pentru diabet înainte sau după operație. Toți subiecții și-au dat consimțământul scris în scris înainte de a participa la acest studiu, care a fost aprobat de Comitetul de studii umane și de Comitetul consultativ științific al Centrului General de Cercetare Clinică al Școlii de Medicină a Universității Washington din St. Louis. Louis, Missouri. Detalii suplimentare referitoare la protocolul experimental, colectarea probelor și analiza probelor pot fi găsite în apendicele suplimentar online.

Analize statistice.

Relațiile dintre expresia genei țesuturilor și caracteristicile metabolice ale subiecților studiați au fost determinate utilizând analiza coeficientului de corelație Pearson. Testul nonparametric Mann-Whitney a fost utilizat pentru a evalua semnificația statistică a diferenței de valori înainte și la 1 an după GBS. Comparații statistice pentru experimentele de cultură celulară au fost făcute utilizând ANOVA cuplat la testul Scheffe. O valoare P ≤0,05 a fost considerată semnificativă statistic.

REZULTATE

Analiza variantelor lipinei 1 de îmbinare.

Analizele RT-PCR au demonstrat că transcrieri lipsă (lipină 1α; 218 bp) sau conținând (lipină 1β; 317 bp) exonul 7 au fost prezente atât în ​​țesutul hepatic și adipos, cât și în ARN din celulele HepG2 (Fig. 1A).

Relația dintre expresia lipinei 1 și IMC sau măsurile de rezistență la insulină.

Expresia lipinei 1 a țesutului hepatic și adipos a fost evaluată la subiecți extrem de obezi (IMC mediu 60,8 ± 2,0 kg/m 2), rezistenți la insulină (evaluarea medie a modelului de homeostazie a rezistenței la insulină [HOMA-IR] 8,1 ± 0,9) sub formă de tabel 1). Expresia lipinei 1β în țesutul adipos a fost invers corelată cu IMC (P = 0,005), concentrația de insulină (P = 0,008) și HOMA-IR (P = 0,001) (Tabelul 1). Expresia lipinei hepatice 1β a fost, de asemenea, inversă legată de IMC (P = 0,04), concentrația plasmatică de insulină (P = 0,03) și HOMA-IR (P = 0,04) (Tabelul 1). Analizele multivariate au confirmat că expresia lipinei 1β a țesutului hepatic și adipos a fost invers legată de concentrația plasmatică a insulinei atunci când au fost controlate alte variabile interdependente, sugerând că scăderea observată cu obezitatea și rezistența la insulină a fost determinată în primul rând de relațiile lor cu concentrația plasmatică de insulină. Cu toate acestea, nu s-a detectat nicio corelație semnificativă între expresia hepatică a lipinei 1α și IMC, insulina plasmatică sau HOMA-IR (Tabelul 1).

Expresia genelor țintă ale lipinei 1 (subunitatea succinat dehidrogenază a [SDHA]) și acil-CoA dehidrogenază cu lanț mediu (MCAD) implicate în metabolismul oxidativ mitocondrial au fost, de asemenea, invers legate de IMC (Tabelul 1). Expresia SDHA a fost invers corelată cu concentrația plasmatică de insulină (P = 0,04) și HOMA-IR (P = 0,03), dar expresia atât a SDHA, cât și a MCAD a fost corelată pozitiv cu expresia lipinei hepatice 1β (Tabelul 1).

A fost detectată o relație puternică între expresia lipinei țesutului hepatic și adipos 1β într-un individ (P = 0,001) (Fig. 1B). În mod surprinzător, expresia hepatică a lipinei 1α și lipinei 1β la un subiect individual nu a fost corelată semnificativ (Tabelul 1).

Efectul pierderii în greutate indusă de GBS asupra expresiei lipinei 1.

Expresia lipinei 1β a crescut cu aproximativ 73% în ficat (P = 0,01) și de 2,6 ori în țesutul adipos (P = 0,01) (Fig. 2) la 1 an după GBS, când subiecții au pierdut 34,5 ± 4,1% din greutatea corporală inițială, au prezentat o reducere de 66,8 ± 4,8% a concentrației medii de insulină plasmatică și au prezentat o reducere de 70,7 ± 5,8% a valorilor medii HOMA-IR (Tabelul 2 suplimentar). În schimb, expresia lipinei 1α a țesutului hepatic și adipos nu a fost modificată semnificativ de pierderea în greutate indusă de GBS (datele nu sunt prezentate). Foarte important, o corelație puternică între expresia lipinei hepatice și a țesutului adipos 1β într-un individ a fost, de asemenea, detectată la subiecți după pierderea în greutate (n = 10; r = 0,6129; P = 0,01).

Expresia genei PGC-1α.

PGC-1α este o proteină coactivatoare transcripțională care controlează expresia lipinei 1 în ficatul șoarecelui (10). Expresia hepatică PGC-1α a fost invers corelată cu concentrația plasmatică de insulină (P = 0,03) și HOMA-IR (P = 0,06), dar nu cu IMC (Tabelul 1). Expresia lipinei 1β și PGC-1α în ficat a fost strâns corelată la subiecții individuali (P = 0,03), în timp ce expresia lipinei hepatice 1α nu s-a corelat cu expresia PGC-1α (Fig. Suplimentară 1).

Reglarea expresiei lipinei 1 prin PGC-1α și insulină.

Izoformele lipinei 1 și expresia lor în țesutul uman. A: Sus: Este prezentată o schemă a proteinelor lipinei 1α și 1β umane. Se remarcă domeniile NH2-terminale (NLIP) și COOH-terminale (CLIP) care sunt foarte conservate între specii și membrii familiei lipinelor. Domeniul de 33 de aminoacizi care distinge lipina 1β de lipina 1α este, de asemenea, prezentat (β). Mijlociu: sunt prezentate locația de legare pentru primerii utilizați în acest studiu și o reprezentare schematică (nu la scară) a structurii exonice care înconjoară exonul 7 în mod alternativ splicat. Partea de jos: Este prezentată o imagine reprezentativă din analiza electroforezei pe gel de agaroză a produselor RT-PCR obținute utilizând ARN colectat din ficat sau țesut adipos al subiecților umani obezi sau celule HepG2. Primerii lipin 1 „fwd” și „splice rev” au fost folosiți pentru analiza PCR. Benzile corespunzătoare transcrierilor lipsite de (lipină 1α) sau care conțin (lipină 1β) exonul 7 migrează la 218 și, respectiv, 317 bp. B: Graficele împrăștiate descriu expresia lipinei hepatice 1β în raport cu expresia lipinei țesutului adipos (AT) la subiecții individuali. UA, unități arbitrare.

Expresia lipinei 1β și PGC-1α este reglată în jos de hiperinsulinemie în celule HepG2 cultivate. A: Graficele descriu expresia lipinei 1β și PGC-1α în ARNm izolat din celule HepG2 cultivate în condiții de control sau hiperinsulinemice. Valorile sunt normalizate (= 100) pentru a controla valorile. B: Graficele descriu expresia lipinei 1β în ARNm izolat din celule HepG2 cultivate în condiții de control sau hiperinsulinemice și infectate cu PGC-1α care supraexprimă adenovirusul și/sau proteina fluorescentă verde (GFP). Valorile sunt normalizate (= 1,0) pentru a controla valorile. C: Graficele descriu expresia SDHA și MCAD în ARNm izolat din celule HepG2 cultivate în condiții de control sau hiperinsulinemice. Valorile sunt normalizate (= 100) pentru a controla valorile. D: Graficele descriu expresia SDHA și MCAD în ARNm izolat din celulele HepG2 cultivate în condiții de control și hiperinsulinemice și infectate cu expresia conducătoare de adenovirus a lipinei 1β și/sau GFP. Valorile sunt normalizate (= 1,0) pentru a controla valorile. * P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Coeficienți de corelație (r) ai expresiei genice

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de un premiu Pilot și Fezabilitate de la Unitatea de Cercetare Nutriție Clinică a Universității Washington (DK56341 la B.N.F.). Acest studiu a fost, de asemenea, susținut de National Institutes of Health Grants DK37948 și RR00036 (către Centrul General de Cercetare Clinică).

Mulțumim Dr. Daniel P. Kelly pentru constructul adenoviral PGC-1α și Dr. Thurl E. Harris și John C. Lawrence pentru constructul lipin 1β adenovirus.

Note de subsol

Publicat înainte de tipărire la http://diabetes.diabetesjournals.org la 11 iunie 2007. DOI: 10.2337/db07-0480.

Informații suplimentare pentru acest articol pot fi găsite într-o anexă online la http://dx.doi.org/10.2337/db07-0480.

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, acest articol trebuie marcat „publicitate” în conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

    • Acceptat la 31 mai 2007.
    • Primit la 5 aprilie 2007.
  • DIABET