Microbiologia sistemelor

Editat de
Yanhong Liu

Universitatea din California, Davis, Statele Unite

Revizuite de
Xi Ma

China Agricultural University, China

JIANGCHAO ZHAO

Universitatea din Arkansas, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

hrănire

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Colegiul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea Agricolă din Nanjing, Laboratorul cheie de prelucrare a produselor din carne, Ministerul Agriculturii și Afacerilor Rurale, Centrul colaborativ de inovare Jiangsu pentru producția și prelucrarea cărnii, controlul calității și siguranței, Nanjing, China
  • 2 Școala de Științe Alimentare, Universitatea Nanjing Xiaozhuang, Nanjing, China

Introducere

Carnea și produsele lactate sunt principalele surse dietetice de proteine ​​animale pentru nutriția umană, care conțin cantități mari și proporții echilibrate de aminoacizi față de țesuturile umane (Li și colab., 2011; FAO, 2013). Prin urmare, consumul adecvat de astfel de alimente este esențial pentru o creștere optimă, dezvoltare și sănătatea umană (Wu, 2016). Consumul de pui a crescut cu 70% în țările dezvoltate din 1990 și devine una dintre cele mai consumate carne, indicând efectele sale crescânde asupra sănătății umane. Caseina este specială pentru conținutul său ridicat de aminoacizi cu lanț ramificat (BCAA) (Rafiq și colab., 2016) și are potențialul de a reduce câștigul de masă corporală și obezitatea indusă de dietă (Lillefosse și colab., 2013; Liisberg și colab., 2016).

Deși proteina de pui și cazeina au fost evaluate ca proteine ​​de înaltă calitate, o intervenție pe termen scurt din grupul nostru a demonstrat că cele două proteine ​​alimentare au dus la modificări fiziologice și transcriptomice hepatice distincte la șobolanii tineri (Song și colab., 2016b). O serie de studii au arătat că există o asociere strânsă între obezitate, dieta bogată în grăsimi și microbiota intestinală (Martinez și colab., 2017). Cu toate acestea, mai multe studii pe termen lung efectuate pe animale au arătat, de asemenea, că cazeina sau CHPD-urile variază în ceea ce privește efectele lor asupra dezvoltării obezității la șoarecii hrăniți cu diete bogate în grăsimi (Liisberg și colab., 2016) și microbiota intestinului la șobolanii hrăniți cu diete grase normale (Zhu și colab., 2015), indicând un impact crucial al surselor de proteine. Recent, s-a demonstrat că microbiota intestinală joacă un rol critic în sănătatea umană prin afectarea fiziologiei, a homeostaziei energetice sau a sistemului imunitar (Rooks și Garrett, 2016; Smidt și colab., 2016; Gomes și colab., 2018). Aportul alimentar ar putea determina diversitatea și rezultatele metabolice ale comunității microbiene (Zmora și colab., 2019). Luate împreună, modificările dietetice asociate microbiotei intestinale ar putea fi legate de metabolismul gazdei. Cu toate acestea, asociațiile dintre microbiota intestinală și gazdă ca răspuns la proteinele dietetice sunt mai puțin investigate. De asemenea, majoritatea analizelor asociate asupra microbiotei intestinale au fost realizate pe baza secvențierii ARNr de 16 secunde, care poate provoca o prejudecată.

În acest studiu, am hrănit șobolani tineri cu cazeină sau CHPD timp de 7 zile și am caracterizat compoziția microbiotei cecale și expresia genelor în țesutul cecal folosind metagenomica puștii și secvențierea transcriptomului. Au fost discutate asocierile dintre bacteriile intestinale, expresia genelor în țesutul cecum și răspunsurile fiziologice.

Materiale și metode

Dietele

Dietele cu proteine ​​au fost preparate de Jiangsu Xietong, Inc., conform formulării AIN-93G (Reeves și colab., 1993). În dietă a fost inclusă cazeina sau proteina de pui. Pentru a asigura coerența dintre diete, majoritatea ingredientelor dietetice au fost achiziționate de la Dyets Inc. (Bethlehem, PA, Statele Unite). Proteina de pui a fost preparată după cum urmează. Pui pectoral major mușchiul a fost gătit într-o baie de apă de 72 ° C până la o temperatură centrală de 70 ° C. Carnea gătită a fost răcită și tocată. Grăsimea a fost îndepărtată în amestec de diclormetan și metanol (1: 2, v: v). Pulberea de carne de pui a fost apoi trecută printr-un ecran de 25. Pulberea este formată din proteine ​​(> 90%) și o cantitate mică de minerali și alți micronutrienți. Informațiile detaliate ale formulei dietetice au fost enumerate în tabelul suplimentar S1.

Hrănirea animalelor

Experimentul pe animale a fost descris anterior (Song și colab., 2016b) și toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire a animalelor de la Nanjing Agricultural University. Pe scurt, după o perioadă de adaptare de o săptămână, șobolanii masculi Sprague-Dawley în vârstă de 4 săptămâni au fost hrăniți fie pe bază de cazeină, fie cu CHPD (câte 10 șobolani fiecare grup). După 7 zile de hrănire, șobolanii au fost anesteziați cu inhalare de eter. Conținutul de Cecal și țesuturile au fost obținute și congelate separat în azot lichid. Trei din cele 10 probe din fiecare grup au fost selectate aleatoriu pentru secvențierea metagenomică (conținut cecal) și transcriptom (țesuturi cecale).

Secvențierea metagenomică

Extracția și secvențierea ADN-ului

ADN-ul genomic a fost extras conform protocoalelor Zoetendal și colab. (2006). Construcția bibliotecii ADN a fost efectuată în urma instrucțiunilor producătorului (Illumina Hiseq 2000). Bibliotecile de ADN cu perechi au fost construite și secvențiate cu o lungime de citire de 100 bp de la fiecare capăt sub o platformă Illumina Hiseq2000 prin conductele standard.

Procesarea datelor

Filtrarea datelor a fost făcută folosind scripturi interne conform conductei MOCAT (Kultima și colab., 2012). Contaminarea adaptorului, citirile de calitate scăzută și citirile care contaminează gazda au fost eliminate din seturile de citiri de secvențare brute. În cele din urmă, au fost obținute date de înaltă calitate pentru analiza metagenomică.

Analiza compoziției și abundenței speciilor

Secvențele bacteriene cunoscute au fost extrase dintr-o bază de date NT și apoi, citirile filtrate au fost mapate pe aceste secvențe de către SOAPaligner (versiunea 2.21) (Li și colab., 2009). Citirile mapate au fost clasificate la diferite niveluri taxonomice (inclusiv filum, clasă, ordine, familie, gen și specie), iar abundența corespunzătoare a fost rezumată. Testul diferenței de distribuție binomială negativă (DEseq2, un pachet R) a fost aplicat pentru analiza diferențială a bacteriilor între cele două grupuri dietetice.

Asamblare și predicție genetică

Datele filtrate au fost asamblate de SOAPdenovo (Li și colab., 2008) (Versiunea 1.06 1), iar rezultatele asamblării au fost optimizate utilizând un program intern (BGI, Shenzhen). Software-ul MetaGeneMark (versiunea 2.10, parametrii impliciți 2) a fost utilizat pentru a prezice cadrele de citire deschise (ORF) pe baza rezultatelor asamblării (Zhu și colab., 2010). ORF-urile din toate eșantioanele au fost combinate fără redundanță (procesate prin software cd-hit, 4.6.1 3) (Li și Godzik, 2006) pentru a obține un catalog de gene. Citirile secvențiale au fost adnotate folosind sarcini de grup KEGG Orthology (Versiunea 59). Un pachet DESeq2 R a fost aplicat pentru analiza diferențială a KEGG Orthology (KO) pe baza datelor de readcount între cele două grupuri dietetice. Analiza de îmbogățire a setului de gene (GSEA) a fost aplicată pentru a evalua modificările exprimării genelor legate de procesele biologice (Subramanian și colab., 2005). Seturile genetice au fost preluate din baza de date a căilor KEGG organizate de experți 4 .

Secvențierea transcriptomului

ARN total a fost extras din țesutul cecal folosind kitul de extracție universal ARN Takara MiniBEST (Takara, Kusatsu, Japonia). Degradarea și contaminarea ARN-ului a fost monitorizată pe geluri de agaroză 1%. Puritatea ARN a fost verificată folosind un spectrofotometru NanoPhotometer ® (IMPLEN, Los Angeles, CA, Statele Unite). Concentrația de ARN a fost măsurată utilizând un kit de testare a ARN-ului Qubit® în fluorometrul Qubit® 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, Statele Unite). Integritatea ARN a fost evaluată utilizând un kit de testare ARN Nano 6000 al sistemului Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Statele Unite).

Pregătirea bibliotecii pentru secvențierea transcriptomului

Clustering și Secvențiere

Gruparea eșantioanelor codificate cu index a fost efectuată pe un sistem de generare a clusterelor cBot utilizând TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumia, Statele Unite), conform instrucțiunilor producătorului. După generarea clusterului, pregătirile bibliotecii au fost secvențiate pe o platformă Illumina Hiseq (Illumina, Statele Unite) și au fost generate citiri de capăt asociat 125 bp/150 bp.

Control de calitate

Datele brute în format fastq au fost prelucrate mai întâi prin scripturi perl interne. Citirile curate au fost obținute prin eliminarea citirilor care conțin adaptor, ploy-N și citiri de calitate scăzută din datele brute. Au fost calculate conținutul Q20, Q30 și GC din datele curate. Toate analizele din aval s-au bazat pe date curate.

Citește maparea la referința genomului

Fișierele de adnotare ale genomului de referință și ale modelului genei au fost descărcate direct de pe site-ul web al genomului. Indexul genomului de referință a fost construit folosind Bowtie v2.2.3 (Langmead și Salzberg, 2012) și citirile curate cu capăt asociat au fost aliniate la genomul de referință folosind TopHat v2.0.12 (Trapnell și colab., 2009).

Analiza expresiei diferențiale

Analiza expresiei diferențiale a fost efectuată pe baza modelului de distribuție binomială negativă utilizând pachetul DESeq2 R (1.24.0). Rezultați P valorile au fost ajustate folosind abordarea lui Benjamini-Hochberg pentru controlul ratei de descoperire falsă (FDR). Gene cu un ajustat P valoare TM RT Master Mix (Perfect Real Time) (Takara, Japonia). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată cu sistemul de PCR în timp real Applied Biosystems ™ QuantStudio ™ 6 Flex (Life Technologies, Waltham, MA, Statele Unite). Analiza datelor a fost în conformitate cu metoda 2-Ct (Livak și Schmittgen, 2001). Grupul hrănit cu cazeină a fost stabilit ca grup de control. Primerii pentru fiecare genă specifică au fost enumerați în tabelul suplimentar S2.

Analiza de corelație a microbiotei intestinale și a expresiei genei gazdă în Cecum

Analiza de corelație a fost efectuată între microbiota intestinală și expresia genei gazdei utilizând pachetul mixOmics R (versiunea 6.1.1 5) (Rohart și colab., 2017). Coeficienții de corelație au fost calculați între toate speciile bacteriene și primele 250 de gene exprimate diferențial.

Rezultate

Efectul pe termen scurt al proteinelor dietetice asupra microbiotei cecale

ADN-ul bacterian a fost extras din conținutul de cecal al șobolanilor hrăniți cu cazeină și CHPD timp de 7 zile. ADN-ul a fost secvențiat folosind secvențierea metagenomului, care a dat 18 baze de date (Gb) de date de înaltă calitate cu o medie de 3 Gb pe probă (Tabelul suplimentar S3). Analiza de distribuție a frecvenței K-mer a arătat că datele secvențiale au fost fiabile (Figura suplimentară S1).

Au fost observate diferențe mari în compoziția microbiotei intestinale la cecum de șobolani hrăniți cu CAD și CHPD. La nivel de filum, Firmicute și Bacteroidete au reprezentat în medie 96,3 și 80,3% din microbiota cecală în grupurile CAD și CHPD (Figura 1A). Analiza componentelor de principiu indică o distincție a compoziției microbiotei intestinale la șobolanii hrăniți cu CAD de cea a șobolanilor hrăniți cu CHPD (Figura 1B).

figura 1. Microbiota cecală a șobolanilor hrăniți cu cazeină și dietă pe bază de proteine ​​de pui. (A) Compoziția microbiană cecală la nivelul filumului. (B) Grafic de împrăștiere PCA la nivelul speciei. (C) Bacteriile diferențiale la nivel de gen (P Cuvinte cheie: cazeină, pui, Lactococcus lactis, AdipoQ, Irs1

Citație: Zhao F, Song S, Ma Y, Xu X, Zhou G și Li C (2019) O alimentare pe termen scurt a cazeinei dietetice crește abundența de Lactococcus lactis și reglează în sus expresia genei care implică prevenirea obezității la Cecum la șobolani tineri în comparație cu proteina dietetică de pui. Față. Microbiol. 10: 2411. doi: 10.3389/fmicb.2019.02411

Primit: 01 iunie 2019; Acceptat: 07 octombrie 2019;
Publicat: 25 octombrie 2019.

Yanhong Liu, Universitatea din California, Davis, Statele Unite

Jiangchao Zhao, Universitatea din Arkansas, Statele Unite
Xi Ma, China Agricultural University (CAU), China