Nutriție și tehnologia științei alimentelor

Editat de
António M. Peres

Institutul Politehnic din Bragança (IPB), Portugalia

Revizuite de
Stefano Sforza

Universitatea din Parma, Italia

Armindo Melo

Facultatea de Farmacie, Universitatea din Porto, Portugalia

Joost Gouw

Nutricia Research (Olanda), Olanda

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

dietetica

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Consiliul Național de Cercetare (CNR), Institutul de Științe Alimentare, Avellino, Italia
  • 2 Departamentul de Științe Medicale Translaționale, Universitatea din Napoli „Federico II”, Napoli, Italia
  • 3 CEINGE Advanced Biotechnologies, Universitatea din Napoli „Federico II”, Napoli, Italia
  • 4 Departamentul Agricultură, Parco Gussone, Universitatea din Napoli „Federico II”, Portici, Italia
  • 5 Laboratorul european pentru investigarea bolilor provocate de alimente, Universitatea din Napoli „Federico II”, Napoli, Italia
  • 6 Task Force on Microbiome Studies, Universitatea „Federico II”, Napoli, Italia

Introducere

Laptele matern conține alergeni alimentari activi antigenic care provin din dieta mamei (1). Această afirmație se bazează în principal pe date imunochimice și investigații clinice efectuate în anii 1980 și 90 (4-6). În acei ani, s-a stabilit clar că alergenii alimentari derivați din dieta mamei pot provoca manifestări clinice ale reacțiilor adverse la nou-născuții sensibili exclusiv alăptați la sân, cu o rată de incidență de 0,5% (7-10). Mai multe studii au documentat prezența unor cantități variabile de alergeni alimentari intacti în laptele matern, inclusiv ovalbumină (11), gliadină (12), arahide (2, 13) și proteine ​​din laptele de vacă (10). S-a raportat că alergenii alimentari din laptele uman variază într-o gamă foarte largă de concentrații de la puțin peste 0,1 până la> 1.000 ng/mL (3), dar nivelurile scăzute de ppb (ng/mL) sunt probabil cele mai realiste cifre (14).

Căutarea alergenilor din laptele de vacă în laptele matern a făcut obiectul unor cercetări fervente. Β-cazeina umană și bovină, αs1-cazeina și α-lactalbumina împărtășesc un grad mediu spre înalt de omologie a secvenței (53, 31 și respectiv 73% omologie) și, prin urmare, o anumită reactivitate imunitară încrucișată. Prin urmare, β-lactoglobulina (β-Lg), care nu este exprimată de oameni, a fost adesea monitorizată ca un marker de lapte de vacă. Conform datelor imunochimice, excreția alergenilor alimentari alimentari în laptele matern pare, în general, să fie afectată de o variabilitate inter- și intra-individuală marcată (11, 14-16). Cu o preocupare specifică pentru alergenii din laptele de vacă, β-Lg exogen a fost detectat doar într-un număr limitat de probe de lapte de mamă, iar prezența sa nu este legată de afecțiuni atopice sau non-atopice (15). Într-un studiu longitudinal efectuat pe întreaga perioadă de lactație, 93 din 232 (adică 40%) probe de lapte matern obținute de la 25 de donatori sănătoși conțineau o cantitate detectabilă de β-Lg din dietă (16). Doar două mame aveau β-Lg detectabil în toate probele de lapte, în timp ce laptele a șase mame nu îl conținea cu nicio ocazie. Recent, Matangkasombut și colab. (17) au raportat că β-Lg din dietă a persistat în laptele uman chiar și până la 7 zile după consumul de lapte de vacă.

Schocker și colab. (23) au exploatat electroforeza bidimensională/Western blot și MS pentru a investiga trecerea Ara h 2 nehidrolizată și a altor alergeni de arahide în laptele matern. Interesant este că au testat probe de lapte uman cu ELISA competitivă pentru a cuantifica posibile peptide rezistente la digestie derivate din proteine ​​de arahide.

Pentru prima dată, am exploatat SM pentru a detecta peptidele care rezultă din digestia cazeinei bovine și a proteinelor din zer excretate în laptele matern al donatorilor care alăptează după o administrare orală de lapte de vacă (24). În special, fragmentele de β-Lg și αs1-cazeină bovine au fost detectate în fracțiunea de 12% tricloracetic (TCA) -solubilă a două și respectiv una din șase probe de lapte matern. În schimb, peptidele β-Lg identificate prin MS de înaltă rezoluție/sensibilitate au scăpat de testul ELISA competitiv efectuat pe lapte nefracționat, sugerând că acestea ar putea apărea cu abundență foarte mică. Așa cum era de așteptat, probele de lapte de control obținute de la șase femei care alăptau și care respectau o dietă strictă fără lapte și jurnal nu aveau peptide derivate din laptele de vacă. Absența β-Lg intactă la cantități detectabile în orice probe de lapte matern a fost confirmată prin electroforeză pe gel de dodecilsulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și analiza Western blot a peletelor de proteine ​​insolubile TCA 12%. Foarte recent, Zhu at al. (25) au obținut un inventar extrem de curatat al peptidelor neumane în laptele uman pe baza datelor MS, iar peptidele derivate din laptele de vacă au fost cele mai reprezentate specii.

În acest studiu, ne-am propus să monitorizăm posibila variabilitate intra-individuală a peptidelor din laptele de vacă dietetic din laptele uman. În acest scop, am vizat peptidele derivate din laptele de bovine din laptele matern prelevat de la un singur donator înainte și după încărcăturile de lapte de vacă orale oportune în diferite zile. În plus, laptele matern a fost prelevat de la aceeași mamă care alăpta pe o perioadă de 6 ore (cinci puncte de timp) după ce a băut lapte de vacă. Janssen Duijghuijsen și colab. (26) a subliniat elegant posibilitatea ca peptidele derivate din alimente de lungime variabilă să poată fi prinse de anticorpii endogeni din fluidele corporale. Astfel, pe lângă fracțiunea solubilă TCA de 12%, am analizat digestia triptică a peletei de proteine ​​insolubile utilizând HPLC-MS/MS.

Materiale și metode

Ditiotreitolul (DTT), iodoacetamida (IAA), guanidina, acidul trifluoroacetic (TFA), bicarbonatul de amoniu (Ambic), Tris-baza, EDTA și alte substanțe chimice au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, SUA). Solvenții HPLC-MS au fost obținuți de la Carlo Erba (Milano, Italia). Izolatul de proteină din zer din laptele bovin utilizat pentru prepararea controalelor pozitive a fost obținut de la Fonterra Dairy Co. prin intermediul Riddett Institute, Noua Zeelandă.

Prelevarea de probe

Un total de 18 probe de lapte matern (5 ml) au fost obținute printr-o pompă de sân echipată cu seturi de plastic de unică folosință. Probele au fost colectate în a doua și a treia lună de lactație după naștere de la un donator sănătos non-atopic (28 de ani) care a livrat la termen. Probele de lapte matern (

5 mL) au fost colectate în diferite zile între 2 și 3 ore după o încărcare orală de 200 mL de lapte bovin pasteurizat. Laptele a fost exprimat în tuburi sterile din plastic, amestecat cu un inhibitor de serină-protează (Pefabloc®, Sigma, St. Louis, MI, SUA, concentrație finală de 1 mM) și congelat imediat la -20 ° C pentru a preveni hidroliza nedorită.

Un screening inițial a fost efectuat pe probele de lapte matern colectate de la donator în 5 zile diferite. Aceste probe au fost desemnate ca D1, D2, D3, D4 și D5. Mama care alăptează a respectat o dietă strictă, fără lapte de vacă și lactate timp de cel puțin 1 săptămână. Per total, 10 probe au fost obținute și analizate individual prin colectarea laptelui matern înainte și după hrănirea bebelușului în fiecare zi de prelevare. Probele din seria D au fost rulate în duplicat. Trei probe de lapte martor (linii de bază) au fost colectate înainte ca mamei să i se administreze lapte de vacă.

După evaluarea prezenței peptidelor derivate din laptele bovin în laptele matern, s-au obținut probe suplimentare de la aceeași mamă. În acest caz, laptele matern a fost colectat pe o perioadă de 6 ore la intervale de timp (1, 2, 3, 4 și 6 ore) în urma unei încărcări orale de lapte bovin. Aceste probe au fost proiectate ca T0 (linia de bază), T1 (1 oră), T2 (2 ore), T3 (3 ore), T4 (4 ore) și T5 (6 ore) și au fost analizate cu HPLC-MS/MS în triplicat. Un operator calificat de la Departamentul de Medicină Translațională al Universității din Napoli „Federico II” (Italia) a supravegheat administrarea laptelui bovin, colectarea probelor și etichetarea codului. Înainte de colectarea probelor de lapte, consimțământul informat scris a fost obținut de la mamă.

Extracția peptidelor

Alicote de probe de lapte matern au fost degresate prin centrifugare (3.000 × g timp de 15 minute la 4 ° C), iar stratul superior de grăsime a fost îndepărtat cu o spatulă (care a fost repetată de două ori). Proteinele laptelui degresat au fost precipitate la 4 ° C cu o concentrație finală de 12% (greutate/volum) acid tricloracetic (TCA) și granulate prin centrifugare (4.500 × g timp de 30 de minute la 4 ° C). Peptidele solubile cu 12% TCA (250 μL) au fost extrase în fază solidă folosind coloane de spin cu fază inversă C18 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, SUA), spălate extensiv cu acid trifluoroacetic 0,1% (TFA) și eluate cu 70% acetonitril . (AcN) conținând 0,1% TFA. AcN a fost evaporat într-un sistem de evaporare SpeedVac ™ și peptidele au fost în cele din urmă liofilizate.

Hidroliza triptică a peletei de proteine

Pentru a îndepărta TCA din peleta reziduală, precipitatul a fost resuspendat în acetonă rece (-20 ° C) și centrifugat la 4.500 × g timp de 30 min la 4 ° C de trei ori. În cele din urmă, 5 mg de pulbere de proteină uscată au fost dizolvate în 1 ml de tampon de denaturare/reducere (6 M guanidină HCI, 0,3 M Tris, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 8,0) și incubate la 56 ° C timp de 1 oră . Ulterior, cisteinele au fost alchilate cu IAA (concentrație finală 55 mM) timp de 40 min la temperatura camerei în întuneric. TDT într-o cantitate stoichiometrică a fost utilizată pentru a stinge excesul de IAA. Proteinele Cys-alchilate (50 μL alicote) au fost diluate de 10 ori cu 25 mM bicarbonat de amoniu (AMBIC) la pH 7,8 și digerate peste noapte la 37 ° C cu tripsină la un raport enzimă-substrat de 1:50 (w: w). Peptidele rezultate au fost purificate utilizând coloane de spin cu fază inversă C18 și liofilizate înainte de analiza HPLC-MS/MS.

ELISA competitivă pentru fragmente β-Lg

Căutare în baze de date și identificarea peptidelor

Datele brute LC-MS/MS au fost analizate cu instrumentul Andromeda al pachetului software MaxQuant (versiunea 1.6.2.10). Căutările au fost limitate taxonomic la Homo sapiens și Bos taurus în baza de date Uniprot (actualizată în noiembrie 2017). Ulterior, căutările au fost rafinate folosind o bază de date proteică construită manual care conține cele mai abundente 30 de produse genetice din laptele de vacă deduse din investigațiile bazate pe proteomă (27, 28). Pentru analiza peptidelor solubile în TCA 12%, condițiile de căutare au inclus scindarea nespecifică, fără modificări statice, oxidarea Met, acid piroglutamic la capătul N-terminal Gln și fosforilarea Ser/Thr ca modificări variabile.

Pentru analiza peletelor de proteine, tripsina a fost selectată ca enzimă proteolitică cu până la două clivaje ratate, iar carbamidometil-cisteina a fost inclusă ca modificare statică. Analiza peptidelor din peletă a fost, de asemenea, repetată în condiții de scindare nespecifică pentru a identifica posibile peptide derivate din laptele bovin care rezultă din digestia mamei și asociate cu anticorpi din laptele matern. În toate cazurile, valoarea toleranței de masă a fost de 5 ppm pentru ionul precursor și de 10 ppm pentru fragmentele MS/MS. Potrivirile spectrului peptidic (PSM) au fost filtrate utilizând abordarea bazei de date de momeală țintă cu o valoare e de 0,01 rata de descoperire falsă la nivel peptidic (FDR), care corespunde unui scor de încredere de 99%. Deoarece există o suprapunere semnificativă între secvențele de proteine ​​din laptele uman și bovin, a fost necesar să se rafineze datele în continuare prin identificarea peptidelor care se potriveau ambilor proteomi. Peptidele care se potriveau exact atât cu secvența bovină cât și cu cea umană au fost eliminate din lista finală de rezultate. Doar peptidele provenite din proteinele relativ abundente din laptele bovin au fost incluse în lista peptidelor bovine identificate.

Rezultate

Datorită unei activități intense de proteaze endogene, laptele uman este intrinsec bogat în oligopeptide (29), care interferează cu detectarea pe bază de SM a unor urme de posibile peptide străine care provin din dieta mamei. Deși căutarea peptidelor derivate din laptele de vacă este practic limitată la relativ puține proteine ​​abundente (cazeină și proteine ​​majore din zer), nu există nicio opțiune de a prezice ce peptide ar putea fi excretate în laptele matern din cauza lipsei substanțiale de specificitate a clivajului pentru degradarea proteinelor în timpul fazelor pre- și post-absorbante din corpul mamei. Astfel, complexitatea analitică a sistemului necesită o combinație de peptidomice „adânci” și „nedestinate” care pot fi abordate numai folosind abordări peptidomice avansate de ultimă generație. O astfel de complexitate ar oferi, de asemenea, un motiv plauzibil pentru care s-au făcut puține sau deloc încercări de a detecta peptidele derivate din alergenii alimentari în laptele uman până acum.

Peptidele dietetice din laptele de vacă din laptele matern

Figura 3. Flux de lucru exemplificativ pentru identificarea peptidei β-cazeină f (81-92) în proba de lapte matern T2. (A) Cromatogramă HPLC MS/MS TIC a peptidelor solubile TCA 12%; (B) Spectrul MS1 la timpul de retenție (RT) 109,0-109,2 min. Inserția din panoul B prezintă o vedere mărită care conține semnalul m/z 660,88 (*); (C) Spectrul MS/MS al semnalului m/z 660,88 cu atribuirea fragmentelor de semnal β-cazeină f (81-92). Peptida de origine dietetică este un semnal MS minor conținut într-un vârf cromatografic cu abundență foarte mică, indicând astfel cantitatea relativă scăzută din laptele matern.

Prin urmare, semnalele peptidelor derivate din lapte au fost de cel puțin 3,5-4 ordine de mărime (5 × 10 3 -10 4-ori) mai puțin intense decât cele ale celor mai abundente peptide endogene ale laptelui matern (intensitate în 1,7-2,9 × 10 10), care provoacă serios gama dinamică a metodei MS.

Aceste descoperiri au demonstrat că peptidele derivate din dieta maternă au apărut la o abundență foarte mică în comparație cu peptidele endogene ale laptelui matern, care la rândul lor reprezintă doar o fracțiune din conținutul de proteine ​​/ polipeptide din laptele uman.

Cifrele cantitative ale acestui studiu reprezintă o estimare brută a abundențelor exogene de peptide. O cuantificare relativă exactă între eșantioanele din seria T ar putea fi realizată prin etichetarea peptidelor cu etichete cu izotop stabil generând fragmente de raportare cu masă redusă (de exemplu, metoda iTRAQ). Cuantificarea absolută a peptidelor alimentare ar necesita un studiu dedicat cu standarde adecvate și ar trebui efectuată eșantion cu eșantion, datorită variabilității compoziției fracției polipeptidice a laptelui uman (25). În pofida clasificării tradiționale a proteinelor dietetice ca „rapide” (proteine ​​din zer) și „lente” (cazeine) pe baza ratelor lor de digestie și absorbție relative (34), peptidele cu apariție timpurie au apărut atât din cazeine, cât și din proteinele din zer. Acest lucru sugerează că fragmentele hidrolitice din cele două familii de proteine ​​ar putea fi destul de rapid digerate, distribuite și excretate în laptele matern.

Analiza Dot-Blot

Peptidele derivate din β-Lg în fracția de peptidă solubilă TCA îmbogățită și purificată cu 12% din probele de lapte matern din seria D au fost vizate prin analiza dot-blot. Extractele peptidice din toate probele au fost recunoscute în mod clar de anticorpul anti-β-Lg, în mod similar digestiei chimotriptice a proteinelor din zer bovine utilizate ca martor pozitiv (Figura 4). În schimb, eșantioanele inițiale de lapte matern colectate înainte de încărcarea orală a laptelui de vacă nu au fost imunoreactive, excluzând astfel posibila reactivitate încrucișată cu peptide provenite din proteinele endogene ale laptelui. Intensitatea petelor imunoreactive nu a putut fi corelată cu numărul și intensitatea ionică a peptidelor derivate din β-Lg detectate de HPLC-MS/MS deoarece posibilele polipeptide β-Lg imunoreactive ar putea scăpa de analiza MS.

Figura 4. Detectarea punct-blot a peptidelor β-Lg imunoreactive în fracția solubilă TCA de 12% din probele de lapte matern din seria D. Probele de bază (BL) au fost extracte de peptide din laptele matern obținute înainte de încărcarea orală a laptelui de vacă. H-β-Lg a fost un digest chimotriptic de β-Lg utilizat ca martor pozitiv.

ELISA competitivă

În încercarea de a cuantifica peptidele β-Lg, am analizat toate probele de lapte matern cu un test ELISA competitiv care a fost dezvoltat în mod specific pentru a determina atât peptidele β-Lg native, cât și peptidele derivate în matricile alimentare procesate. Soluțiile standard β-Lg se potrivesc unei curbe de spline cubice, în conformitate cu liniile directoare ale producătorului. Niciuna dintre probele de lapte matern nu conținea peptide β-Lg detectabile la limita declarată de detectare de 2,1 ppm, confirmând rezultatele noastre anterioare (24). Sensibilitatea ELISA competitivă a fost cel mai probabil inadecvată pentru a detecta peptidele β-Lg, ceea ce apare plauzibil la cantități mici de ppb conform unei estimări brute bazate pe intensitățile relative ale semnalului MS. Probele de lapte matern mai puțin diluate (adică 1/50 și 1/100) testate de ELISA au dat rezultate inconsistente datorită interferenței matricei. În general, metodele bazate pe ELISA pot duce la rezultate fals-pozitive și fals-negative atunci când sunt aplicate la determinarea urmelor alergenelor în matricile alimentare complexe, ceea ce subliniază necesitatea unor metode analitice care nu se bazează pe recunoașterea antigen-anticorp (35).

Căutarea peptidelor din laptele de vacă în peleta de proteine

Polipeptidele dietetice din fluidele corporale, în special sângele sau laptele matern, pot fi preluate de anticorpi sau asociate cu proteine ​​prin interacțiuni nespecifice. Un astfel de rezultat ar putea explica, de asemenea, de ce metodele ELISA nu au reușit să detecteze acele fragmente de proteine ​​relevate de SM (26). Pentru a viza posibilele proteine ​​din laptele de vacă intacte sau peptidele dietetice asociate cu anticorpi purtători sau proteine ​​din laptele matern, peleta de proteine ​​insolubile în TCA 12% a fost redusă Cys/alchilată în tampon de denaturare (6 M guanidină), iar digestia triptică rezultată au fost analizate prin HPLC-MS/MS. Baza de date care conține secvențe de proteine ​​din laptele de vacă a fost căutată utilizând atât specificitatea clivajului tripsinei, fie clivajul nespecific. În medie, aproape 400 de proteine ​​endogene per probă au fost identificate cu mare încredere (1% FDR, e Cuvinte cheie: lapte matern, proteine ​​din laptele de vacă, alergeni alimentari, digestie proteică, HPLC-MS/MS, Western blot, β-lactoglobulină, alăptare

Citare: Picariello G, De Cicco M, Nocerino R, Paparo L, Mamone G, Addeo F și Berni Canani R (2019) Excreția peptidelor derivate din laptele de vacă dietetic în laptele matern. Față. Nutr. 6:25. doi: 10.3389/fnut.2019.00025

Primit: 20 decembrie 2018; Acceptat: 20 februarie 2019;
Publicat: 12 martie 2019.

António Manuel Peres, Institutul Politehnic din Bragança, Portugalia

Armindo Melo, Universitatea din Porto, Portugalia
Stefano Sforza, Universitatea din Parma, Italia
Joost Gouw, Nutricia Research, Olanda