Neurodegenerare

Editat de
CHENG-XIN GONG

Institutul de cercetare de bază în dizabilitățile de dezvoltare (IBR), Statele Unite

Revizuite de

Gadi Turgeman

Universitatea Ariel, Israel

Binkai Chi

Harvard Medical School, Statele Unite ale AmericiiΑ

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

regulator

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laborator cheie Shenzhen pentru biologie structurală neuronală, Institutul de cercetare biomedicală, Universitatea Shenzhen Peking - Centrul medical al Universității de Știință și Tehnologie din Hong Kong, Shenzhen, China
  • 2 Laboratorul cheie din Shenzhen pentru medicina translațională a dermatologiei, Institutul de cercetare biomedicală, Universitatea Shenzhen Peking - Centrul medical al Universității de Știință și Tehnologie din Hong Kong, Shenzhen, China
  • 3 Departamentul de dermatologie, Universitatea din Beijing Spitalul Shenzhen, Shenzhen, China
  • 4 Divizia de Științe ale Vieții, Universitatea de Știință și Tehnologie din Hong Kong, Hong Kong, China

Introducere

Boala Alzheimer (AD) este cea mai frecventă cauză de demență la vârstnici. Este o tulburare neurodegenerativă ireversibilă, cu semnele distinctive ale plăcilor senile, încurcăturilor neurofibrilare (NFT) și pierderii neuronale (Barker și colab., 2002; Vinters, 2015). Simptomele clinice ale AD includ pierderea recentă a memoriei, judecata defectuoasă, modificările personalității și pierderea progresivă a puterii de raționament (Robakis, 2011). Deși a fost explorată pe scară largă, patogeneza exactă a AD rămâne de elucidat.

MicroARN-urile (miR-urile) sunt ARN-uri dublu catenare care joacă roluri de reglementare în exprimarea proteinelor (Iwakawa și Tomari, 2015). Expresia proteinelor reglementate de miR joacă un rol important în patogeneza AD, iar miR-urile au potențialul de a fi o abordare mai sensibilă pentru detectarea și gestionarea AD (Basavaraju și de Lencastre, 2016; Gupta și colab., 2017; Reddy și colab., 2017). Anomaliile cito-scheletice și afectarea sinaptică sunt tipice în stresul indus de β (Aβ) amiloid (Bamburg și Bernstein, 2016). MiR-urile au capacitatea de a regla modificările cito-scheletice în multe boli, în special cancerele (Gross, 2013; Kanakkanthara și Miller, 2013; Zhang și colab., 2019).

Citoscheletul joacă un rol vital în menținerea sistemului nervos până la vârsta adultă. Modificările neurofilamentelor și ale proteinelor asociate microtubulilor au fost legate de o varietate de boli neurodegenerative (Bettencourt și Cruz și colab., 2005). În stadiile incipiente ale AD, s-a știut că citoscheletul este perturbat în neuroni. Proteina Tau este hiperfosforilată în AD, ceea ce duce la formarea de încurcături și la asamblarea anormală a microtubulilor (Lindwall și Cole, 1984; Alonso și colab., 1996). Pe lângă tau, multe alte proteine ​​implicate în reglarea citoscheletului ar putea fi legate de patogeneza AD (Bamburg și Bernstein, 2016; Brandt și Bakota, 2017). Studiile noastre anterioare au arătat, de asemenea, că miARN-urile care au reglementat creșterea neuritei au fost, de asemenea, implicate în afectarea neuronală indusă de Aβ (Ye și colab., 2015; Fan și colab., 2016). Întreaga secvențiere a transcriptomului a arătat că unele proteine ​​asociate cu citoscheletul au fost reglate în sus în cortexele șoarecilor transgenici APPswe/PS1ΔE9 (șoareci APP/PS1) comparativ cu șoarecii martori de vârstă (baza de date NCBI GEO: GSE87550), inclusiv familia asemănătoare RAS (Rasl12), pleckstrin (Plek) și proteina de legare sindecan 2 (Sdcbp2). Plek ar putea induce reorganizarea cito-scheletului prin intermediul o cale dependentă de rasă (Ma și Abrams, 1999; Baig și colab., 2009). Membrii familiei Syndecan, în concordanță cu Sdcbp2 (Syndecan Binding Protein 2, Syntenin2), pot intermedia creșterea neuritei dependente de apoE prin interacțiunea cu filamentul de actină (Zimmermann și colab., 2005; Kim și colab., 2014).

În acest studiu, investigăm rolul miR-409-5p în reglarea creșterii neuritei, vizând Plek, care poate contribui la eșecul sinaptic și disfuncția cognitivă în AD.

Materiale și metode

Reactivi

Anticorpii policlonali de iepure împotriva Plek (12506-1-AP) și SDCBP2 (10407-1-AP) provin de la ProteinTech Company. Anticorpul policlonal de iepure împotriva α-tubulinei (# 2144) a fost de la Cell Signaling Technologies. Anticorpul monoclonal de șoarece împotriva β-tubulinei III (T8575), anticorpul secundar IgG anti-iepure de capră (A9169) și Aβ1-42 (03111) au fost de la Sigma. Imitatorii sau inhibitorii miR-409-5p au fost sintetizați de RiboBio Company.

Construcția plasmidei

Fragmentele 3'UTR de Plek și Sdcbp2 de șoarece au fost amplificate prin PCR dintr-o bibliotecă de ADNc de șoarece. Ampliconul PCR a fost donat în vectorul psiCHECK2 între Xhoeu si NuSite-uri I folosind un kit de clonare cu un singur pas ClonExpress ® II (Vazyme). Pentru analiza activității luciferazei, am introdus mutații pe fiecare sit de legare miR-409-5p miR prin suprapunere PCR. ADNc-ul Plek al mouse-ului a fost amplificat prin PCR și donat în vectorul PTGFP (o formă vectorială modificată pEGFP-C1) de Xhoeu si EcoSite-uri RI. Toate secvențele de exemplu au fost prezentate în Tabelul 1. Secvențele tuturor constructelor au fost confirmate prin secvențierea ADN-ului.

tabelul 1. Secvențe de mimici/inhibitori miR sintetizați sau siARN.

Animale

Șoarecii transgenici dubli APPswe/PS1ΔE9 conțineau două gene umane mutante, APP695 cu mutație suedeză K595N/M596L și Presenilin1 fără exon9 (PS1ΔE9). Șoarecii au provenit inițial de la Laboratorul Jackson (Borchelt și colab., 1996) și au fost achiziționați de la Centrul de Cercetare Animal Model al Universității Nanjing (Nanjing, China). Protocolul experimental, aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale, Universitatea Shenzhen-Peking-Centrul Medical al Universității de Știință și Tehnologie din Hong Kong (SPHMC) (numărul de protocol 2011-004), a fost realizat așa cum a fost descris anterior (Wan și colab. ., 2010).

Culturi celulare și transfecție

Celulele PC12, celulele Neuro2A și celulele HEK293T au fost cultivate așa cum s-a descris anterior (Fan și colab., 2016; Wu și colab., 2016). Neuronii hipocampici primari au fost preparați din embrionii embrionari din ziua 18,5 de șoareci C57B6. Hipocampul a fost disecat, tocat și tripsinizat. Neuronii au fost însămânțați pe cutii Petri acoperite cu poli-D-lizină (Sigma) și cultivate în mediu neurobazal (Life Technologies) conținând 2% B27 (Life Technologies) și 0,5 mM L-glutamină într-un incubator umidificat la 37 ° C cu 5% CO2. Celulele PC12, celulele Neuro2A sau neuronii primari ai hipocampului au fost transfectați cu miR-409-5p mimic sau inhibitor prin reactivul de transfecție ViaFect (Promega) conform instrucțiunilor producătorului.

Aβ1-42 Tratament

Aβ1-42 (03111, Sigma) a fost dizolvat cu 1% hidroxid de amoniu prin amestecare cu pipetă, urmat de diluarea la 200 μM în PBS. Aβ1-42 diluat a fost incubat la 37 ° C peste noapte pentru a induce agregarea înainte de utilizare. Aβ1-42 agregat a fost diluat la 4-10 μM ca concentrație finală cu mediu de cultură și tratat la celule. Toxicitatea celulară indusă de Aβ1-42 a fost detectată în neuronii hipocampici de cultură primară (Figura suplimentară S1).

Analiza viabilității celulare

Cinci mii de neuroni hipocampici au fost plasați în fiecare godeu într-o placă cu 96 de godeuri. Au fost transfectate două sute de nanomolari de miR-409-5p. Patruzeci și opt de ore după transfecție, neuronii hipocampului au fost incubați cu CellTiter 96 AQueous (Promega) timp de 4 ore pentru a forma formazan purpuriu insolubil. Apoi, absorbanța la OD490 a fost măsurată cu un cititor de plăci ELISA (BioRad). Toate experimentele au fost repetate de cel puțin trei ori.

Luciferase Reporter Assay

Celulele 293T au fost cotransfectate cu tip sălbatic (WT) sau mutate psiCHECK-Plek-3′UTR sau psiCHECK-Sdcbp2-3′UTR și miR-409-5p timp de 24 de ore. Lizatul celular a fost recoltat și setul de testare a genei reporterului luciferazei (Promega) a fost utilizat pentru a măsura activitățile luciferazei. Toate experimentele au fost repetate de cel puțin trei ori.

Extracția ARN și PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras folosind reactivul TRIzol (Life Technologies) conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea de ARN a fost măsurată de NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). ADNc a fost sintetizat și PCR cantitativă (qPCR) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Wu și colab., 2016). ADNc a fost sintetizat din 100 ng de ARN total prin primeri RT specifici miR utilizând un sistem de transcripție inversă (Promega). qPCR a fost efectuat ulterior în triplicat cu o diluție 1: 4 de ADNc folosind 2 × SYBR verde SuperMix (Bio-Rad) pe un sistem de detecție PCR în timp real CFX96 Touch (Bio-Rad). Nivelul de expresie al miR-409-5p a fost normalizat față de cel al U6. Gliceraldehidă-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca control al cuantificării mRNA Plek și Sdcbp2. Datele au fost colectate și analizate cu ajutorul software-ului Bio-Rad folosind metoda 2 –ΔΔCt pentru cuantificarea nivelurilor relative de expresie. Secvențele de exemplu au fost prezentate în tabelul 2. Toate experimentele au fost repetate de cel puțin trei ori.

masa 2. Secvența primerilor utilizați pentru PCR în timp real.

Western Blotting

Celulele au fost lizate în tampon RIPA cu cocktail inhibitor de protează (Thermo Scientific) pe gheață timp de o jumătate de oră. Lizatul cerebral a fost recoltat și supus SDS-PAGE așa cum s-a descris anterior (Wu și colab., 2016). Proteinele separate prin gel au fost apoi transferate pe membrana NC urmată de Western blot cu un anticorp primar 1: 200 la 4 ° C peste noapte și un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean 1: 5.000 timp de 2 ore la temperatura camerei. Semnalele au fost dezvoltate cu substratul chemiluminiscent Super Signal West Pico (Thermo Scientific). Densitatea optică a fost cuantificată prin Cantitatea Unu (Bio-Rad). Software-ul ImageJ a fost utilizat pentru a cuantifica valorile gradului de gri.

Imunomarcarea fluorescenței

Celulele au fost fixate timp de 30 min la temperatura camerei într-o soluție de 4% PFA și apoi permeabilizate și blocate în PBS conținând 1% BSA, 4% ser de capră și 0,4% Triton X-100 timp de 30 min la temperatura camerei. Anticorpul primar (anti-β-tubulină III, 1: 500, Sigma, anticorp monoclonal de șoarece) la 4 ° C a fost folosit pentru a incuba celulele peste noapte, urmat de anticorp secundar conjugat cu fluorescență (anti-șoarece 555, 1: 500, Jackson Immuno Research) timp de 2 ore la temperatura camerei. În cele din urmă, celulele au fost colorate cu DAPI timp de 5 minute, apoi spălate cu PBS urmată de apă deionizată și montate cu mediu de montare antifade (Beyotime). Imaginile cu neuroni au fost surprinse de un microscop confocal Zeiss LSM 710 cu un obiectiv de 40 ×. Imaginile au fost analizate cu Zen 2012 (Zeiss) și ImageJ (NIH).

Cuantificarea creșterii neuritei

În studiul morfologic al celulelor, lungimea celei mai lungi neurite și lungimea totală a neuritei au fost măsurate pentru a cuantifica creșterea neuritei utilizând software-ul ImageJ. Pentru fiecare măsurare, au fost numărate cel puțin 100 de celule din câmpurile selectate aleatoriu. Fiecare experiment a fost repetat de cel puțin trei ori. Numărul total de vârfuri a fost numărat pentru a reprezenta numărul de neurite din celule individuale.

Analiza computațională a țintelor miR-409-5p

Genele țintă pentru miR-409-5p au fost prezise de patru baze de date: miRDB 1, mi-Randa 2, DIANA microT-CDS (v5) 3 și targetScan 4. Pentru a restrânge grupul potențialelor ținte, p-pragul valoric și pragul de microfon au fost setate să fie 0,05 și respectiv 0,7. Instrumentul Venn 5 a fost folosit pentru a lua intersecția celor patru gene țintă ale bazei de date. Funcțiile biologice și adnotarea căilor KEGG ale genelor de intersecție au fost analizate de Genologia Ontologiei 6 și respectiv DIANA.

Analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± SD. Comparațiile statistice au fost făcute utilizând software-ul SPSS 20.0. Neimperecheat t-testul a fost utilizat pentru a analiza diferențele dintre două grupuri, ANOVA urmat de post hoc analiza folosind testul Dunnett a fost utilizată în mai multe grupuri, iar ANOVA bidirecțională a fost utilizată pentru a analiza diferențele între diferite vârste ale șoarecilor WT și APP/PS1. P-valoare ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗ p ∗ p ∗∗ p 1.2) la șoareci APP/PS1 printr-o întreagă secvențiere transcriptomă efectuată anterior în laboratorul nostru.

Tabelul 3. Nouă gene pot ține gene.

Cele 3′UTR ale Plek și Sdcbp2 au fost analizate prin baza de date miRanda. Predicția bazei de date a indicat că Plek avea două situri de legare miR-409-5p în 3’UTR și Sdcbp2 avea unul (Figura 6A). Pentru a explora rolul potențial al miR-409-5p în reglarea translațională a genelor țintă, am co-transfectat un constructor reporter de luciferază care conține diferite fragmente de Plek 3'UTR sau Sdcbp2 3'UTR împreună cu miR-409-5p. Cotransfecția miR-409-5p a dus la o scădere a activității luciferazei atunci când cu expresia fragmentului Plek 3'UTR pe toată lungimea conținând site-ul I și Sdcbp2 3'UTR (Figurile 6B, C). De asemenea, am generat mutații direcționate către situs pe site-ul Plek 3'UTR I și Sdcbp2 3'UTR, iar inhibiția activității luciferazei a dispărut. Am constatat că miR-409-5p a suprimat în mod semnificativ nivelurile de expresie ale mARN-ului și proteinelor Plek în neuronii hipocampici de șoarece primari (figurile 6D, F), în timp ce nu a avut niciun efect asupra expresiei Sdcbp2 (figurile 6E, G). Rezultatele noastre au indicat faptul că Plek ar putea fi una dintre genele țintă miR-409-5p.

Figura 6. Plek și Sdcbp2 ar putea fi țintele miR-409-5p. (A) Siturile de legare de tip sălbatic (WT) și plek mutant sau Sdcbp2 cu miR-409-5p. (B) Luminiscența relativă Renilla/luciferază a unui construct psiCHECK2 vector care adăpostește Plek sau Plek mutant cotransfectat cu miR-409-5p în celulele HEK 293T, cu vectorul psiCHECK2 gol ca control. (C) Luminiscența relativă Renilla/luciferază a unui vector psiCHECK2 construit adăpostind Sdcbp2 sau Sdcbp2 mutant cotransfectat cu miR-409-5p în celulele HEK 293T, cu vectorul psiCHECK2 gol ca control. Rezultatele au fost prezentate ca medie ± SD (∗ p ∗∗ p ∗ p ∗ p ∗ p ∗∗ p Cuvinte cheie: boala Alzheimer, peptida beta amiloidă, microARN, mir-409-5p, Plek

Citare: Guo J, Cai Y, Ye X, Ma N, Wang Y, Yu B și Wan J (2019) MiR-409-5p ca regulator al creșterii neuritei este reglementat în jos în APP/PS1 Modelul murin al bolii Alzheimer. Față. Neuroști. 13: 1264. doi: 10.3389/fnins.2019.01264

Primit: 20 august 2019; Acceptat: 07 noiembrie 2019;
Publicat: 28 noiembrie 2019.

Cheng-Xin Gong, Institutul de cercetare de bază în dizabilitățile de dezvoltare (IBR), Statele Unite

Binkai Chi, Harvard Medical School, Statele Unite
Gadi Turgeman, Universitatea Ariel, Israel