Nutriție și microbi

Editat de
Silvia Turroni

Universitatea din Bologna, Italia

Revizuite de
Ravinder Nagpal

Wake Forest School of Medicine, Statele Unite

Nobuhiko Kamada

Michigan Medicine, Universitatea din Michigan, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

modifică

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Program de biologie celulară, Institutul de cercetare, Spitalul pentru copii bolnavi, Toronto, ON, Canada
  • 2 Divizia de Gastroenterologie, Hepatologie și Nutriție, Departamentul de Pediatrie, Toronto, ON, Canada
  • 3 Departamentul de Medicină de Laborator și Patobiologie, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada
  • 4 Fiziologie și medicină experimentală, Institutul de cercetare, Spitalul pentru copii bolnavi, Toronto, ON, Canada
  • 5 Departamentul de Medicină, Departamentul de Biochimie și Științe Biomedicale, Universitatea McMaster, Hamilton, ON, Canada
  • 6 Divizia de Chirurgie Generală și Toracică, Spitalul pentru Copii Bolnavi, Toronto, ON, Canada
  • 7 Farncombe Family Digestive Health Institute, Universitatea McMaster, Hamilton, ON, Canada

Scop: Boala inflamatorie a intestinului (IBD) se referă la un spectru de boli autoimune, care are ca rezultat inflamații intestinale cronice. Descoperirile anterioare sugerează un rol pentru dietă, nutriție și disbioză a microbiotei intestinale atât în ​​dezvoltarea, cât și în progresia afecțiunii. Vitamina B12 este un cofactor cheie al metioninei sintază și este produsă exclusiv de microbi. Lucrările anterioare leagă niveluri crescute de homocisteină, un substrat al metioninei sintază, MetH, la IBD, indicând un rol potențial pentru deficitul de vitamina B12 în leziunile și inflamațiile intestinale. Acest studiu a evaluat rolul vitaminei B12 în modelarea microbiotei intestinale și determinarea răspunsurilor la leziunile intestinale utilizând un model reproductibil de colită murină.

Metode: Au fost evaluate efectele suplimentării și deficienței de vitamina B12 in vivo; Șoarecii C57Bl/6 în vârstă de 3 săptămâni au fost împărțiți în trei grupe de tratament dietetic: (1) suficientă vitamina B12 (50 mg/kg), (2) deficit de vitamina B12 (0 mg/kg) și (3) suplimentată vitamina B12 (200 mg/Kg) pentru o perioadă de 4 săptămâni. Leziunea intestinală a fost indusă cu 2% sulfat de sodiu dextran (DSS) prin apă potabilă timp de 5 zile. Impactul diferitelor niveluri de vitamina B12 dietetice asupra compoziției microbiotei intestinale a fost evaluat folosind secvențierea genei 16S rRNA din probe fecale colectate în ziua 0 și ziua 28 a intervenției dietetice și la 7 zile după inducerea colitei în ziua 38, când sângele și colonul au fost colectate și țesuturi.

Rezultate: Nu s-au găsit modificări semnificative în compoziția microbiotei intestinale a animalelor fără boală ca răspuns la intervențiile dietetice. Prin contrast, după colita indusă de DSS,> 30 de genuri au fost modificate semnificativ la șoarecii cu deficit de vitamina B12. Nivelurile modificate de B12 nu au produs niciun efect semnificativ asupra scorurilor compozite ale activității bolii; cu toate acestea, administrarea unei diete cu deficit de B12 a dus la reducerea deteriorării țesutului epitelial indus de DSS.

Concluzii: Suplimentarea cu vitamina B12 nu modifică compoziția microbiotei intestinale în condiții sănătoase, dar contribuie la răspunsuri microbiene diferențiale și la disbioză intestinală după inducerea colitei experimentale.

Introducere

Boala inflamatorie a intestinului (IBD) cuprinde un spectru de boli intestinale, inclusiv colita ulcerativă și boala Crohn (1) și se caracterizează prin inflamație cronică, recidivantă și remitentă a mucoasei în tractul intestinal (2). Dovezi în creștere asociază dezvoltarea IBD cu diversitatea microbiană redusă a microbiotei intestinale (3) și modificări dietetice (4) la o gazdă susceptibilă genetic (5). Deși cauza directă a dezvoltării IBD nu este încă pe deplin înțeleasă, deficiențele micronutrienților sunt asociate în mod obișnuit cu IBD. În cadrul acestei populații subnutriția este frecvent asociată atât cu aportul alimentar inadecvat, cât și cu absorbția inadecvată din cauza activității bolii intestinale de bază. Prin urmare, s-a presupus că deficiențele micronutrienților joacă un rol fie în dezvoltarea, fie în progresia IBD (6).

Vitamina B12, cunoscută și sub numele de cobalamină, acționează ca o coenzimă a metioninei sintază care catalizează conversia homocisteinei în metionină (7). Deficitul de vitamina B12 duce la hiperhomocisteinemie caracterizată prin niveluri ridicate de homocisteină (8). Hiperhomocistiena este un factor de risc stabilit pentru bolile cardiovasculare și este asociată cu rigiditatea peretelui arterial (9), care este adesea crescută la pacienții cu IBD (10). O asociere a hiperhomocisteinemiei cu IBD a fost, de asemenea, descrisă anterior (11), cu niveluri crescute de homocisteină prezente în țesuturile intestinale ale pacienților cu IBD (atât boala Crohn, cât și colita ulcerativă), comparativ cu mucoasa intestinală prelevată din controale sănătoase (12). Hiperhomocisteinemia poate rezulta și din deficiența de folat, deoarece atât folatul, cât și vitamina B12 sunt cofactori importanți ai metioninei sintazei (13).

Până în prezent, există rezultate contradictorii cu privire la efectele stării vitaminei B12 asupra inflamației intestinale și niciun studiu nu a investigat dacă modificările compoziției microbiomului intestinal sunt asociate cu deficiența vitaminei B12. Benight și colab. (14) au raportat că deficitul de vitamina B12 protejează împotriva colitei induse de DSS la șoareci. Prin contrast, Bressenot și colab. (15) au observat o funcție redusă a barierei intestinale la șobolanii cu deficit de vitamina B12. Un al treilea studiu a constatat variații ale efectelor administrării acute de cobalamină într-un model murin de colită bazat pe starea sa bioactivă: metilcobalamina având mai multe proprietăți antiinflamatorii, în timp ce cianocobalamina sintetică a avut un efect mai pro-inflamator (16).

Tractul gastrointestinal este locul principal al bolii în IBD, cu regiuni specifice afectate diferențial în funcție de subtipul bolii. Tractul gastrointestinal găzduiește, de asemenea, miliarde de microorganisme care formează o comunitate complexă denumită microbiota intestinală. Microbiota intestinală ajută la dezvoltarea sistemului imunitar al gazdei, la metabolismul energetic și la apărarea împotriva agenților patogeni enterici (17-19). Microbiomul intestinal poate fi modificat într-o varietate de boli cronice netransmisibile (20), nutriția având un impact semnificativ asupra microbiotei intestinale. Numeroase studii indică faptul că modificările dietetice pot modifica atât compoziția, cât și funcția microbilor intestinali (21). Prin urmare, în acest studiu am evaluat impactul modificărilor vitaminei B12 dietetice asupra severității leziunii mucoasei și a compoziției microbiotei fecale într-un model murin de colită.

Materiale și metode

Model animal

Șoareci C57BL/6 femele înțărcate de trei săptămâni (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) au fost găzduite în unitatea de izolare a unității de servicii pentru animale de laborator de la Spitalul pentru copii bolnavi (Toronto, ON, Canada). Toate procedurile și protocoalele au fost respectate și au fost aprobate de Comitetul de îngrijire a animalelor de la Spitalul pentru copii bolnavi (Protocolul nr. 37290). Șoarecilor li s-a permis accesul gratuit la chow și la apă potabilă sterilă în timpul protocolului de studiu (Figura 1). Trei diete personalizate Teklad au fost achiziționate de la Harlan Laboratories Canada Ltd. (Toronto, ON, Canada). Toate cele trei diete au constat într-o modificare a dietei standard AIN-93G pentru rozătoare cu cazeină spălată cu etanol pentru a reduce fondul B12: 1) vitamina B12 suficientă 50 mg/kg, 2) deficit de vitamina B12 0 mg/kg și 3) vitamina B12 suplimentată 200 mg/Kg. Concentrațiile de vitamina B12 (cianocobalamină) în chow au fost măsurate de laboratoarele ENVIGO (Madison, WI) după iradiere folosind metodele oficiale de analiză, metodele 952.20 și 960.46, AOAC INTERNATIONAL (Gaithersburg, MD). Toate dietele au fost potrivite pentru compoziția macronutrienților și conținutul de energie (18,3% proteine, 60,1% carbohidrați, 7,0% grăsimi în greutate, 3,8 Kcal/g).

figura 1. Reprezentare grafică a proiectului experimental pentru administrarea vitaminei B12 într-un model de colită de șoarece indus de dextran de sulfat de sodiu (DSS). Șoarecii C57BL/6 de trei săptămâni au primit diete specifice care conțin nivele variate de vitamina B12 timp de 4 săptămâni. DSS a fost administrat timp de 5 zile urmat de 2 zile de apă singură. Peletele fecale au fost obținute în zilele 0, 28 și 38. Probele de sânge și colon au fost colectate în momentul sacrificării în ziua 38.

Șoarecii au fost împărțiți într-un grup experimental DSS (n = 15) și grupul de controln = 9). Atât șoarecii din grupul experimental DSS, cât și șoarecii din grupul de control au fost împărțiți în 3 grupuri de tratament dietetic: (1) suficientă vitamina B12 (2) cu deficit de vitamina B12; (3) vitamina B12 suplimentată. Includerea unui grup de control cu ​​niveluri suficiente de vitamina B12 a fost inclusă pentru a permite o evaluare a schimbărilor în microbiomul intestinal în raport cu tranziția de la laptele matern la chow-ul de șoarece. Șoarecii au fost cântăriți și peletele fecale colectate în ziua 0, ziua 28 și ziua 38 pentru a evalua schimbările în comunitățile microbiene. DSS a fost administrat în apă potabilă (2% în greutate/volum, MP Biomedicals, Solon, OH) în ziua 31 timp de 5 zile numai grupului experimental DSS, după care animalele au primit apă singură timp de 2 zile (22). Animalele au fost monitorizate pentru schimbări în greutate, sănătate și bunăstare și variații înregistrate pe parcursul procedurii experimentale.

Analiza nivelurilor de vitamina B12 în ser

Sângele întreg a fost obținut din vena facială în ziua 29, cu două zile înainte de inducerea DSS a colitei. Probele de sânge au fost centrifugate la 2.300 × g, la 4 ° C timp de 20 de minute și serul a fost izolat și depozitat la -20 ° C. Nivelurile de vitamina B12 au fost măsurate cantitativ folosind testul factorului intrinsec de microparticule chemiluminescente (testul ARCHITECT B12; Abbot Park, IL).

Evaluarea leziunii epiteliale

La sfârșitul protocolului de studiu, animalelor li s-a administrat CO2 înainte de dislocarea colului uterin, iar colonele au fost excizate și lungimile măsurate ex-corpus. Segmente de colon distal au fost fixate în formalină cu tampon neutru 10% și parafină încorporate. Probele au fost apoi secționate, colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și vizualizate folosind un microscop Leica DMI 6000B echipat cu o cameră Leica DFC420 (Leica, Dialux 22: Leica Systems, Willowdale, ON, Canada), așa cum a fost descris anterior (23). Secțiunile de țesut au fost evaluate și punctate de o persoană orbită. Histopatologia a fost clasificată numeric prin scorurile activității bolii (DAS), constând în scorul combinat al severității leziunii țesutului epitelial (gradat 0-3, de la absent la ușor incluzând leziuni epiteliale superficiale, moderate incluzând eroziuni focale și severe inclusiv eroziune multifocală), extinderea infiltratului celular inflamator (gradat 0-3, de la absent la transmural) și epuizarea celulelor calice (gradată 0-2, de la nicio modificare a numărului de celule calice la celule calice vizibile), așa cum s-a descris anterior (24).

Imunofluorescența

Detectarea producției de Muc2 în țesuturile colonice a fost efectuată pe secțiuni fixe, așa cum s-a descris anterior (25). Pe scurt, secțiunile de colon au fost incubate cu iepure primar anti-Muc2 (Santa-Cruz, Dallas, TX) peste noapte la 4 ° C urmate de Alexa Fluor 488-conjugat secundar (Invitrogen, Carlsbad, CA) și DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA ) la temperatura camerei timp de 2 ore. Imaginile au fost achiziționate folosind un microscop digital Nikon TE-2000 echipat cu o cameră Hamamatsu C4742-80-12AG.

Transcriere inversă QPCR

Probele de colon distal cu grosime completă au fost colectate în momentul sacrificării și congelate la -80 o C. Țesuturile colectate au fost omogenizate și ARN-ul total a fost extras de Trizol (Invitrogen). ARN izolat a fost tratat cu DNază A (Invitrogen), conform recomandărilor producătorului. Calitatea și randamentul ARN au fost evaluate prin rapoartele A260/A280 și A260/A230 și analizate cu un spectrofotometru Nano-Drop® ND-1000 (NanoDrop Technologies). Un total de 1 μg de ARN a fost transcris în ADNc, utilizând un kit de sinteză ADNc iSCRIPT (Bio-Rad). ADNc a fost amplificat prin qPCR, utilizând SsoFast EvaGreen Supermix și un ciclor termic CFX96 C1000 (Bio-Rad). Au fost folosite grunduri împotriva GAPDH de șoarece și proteina ribozomală L10 (RPL10) (gene de menaj), interleukina-10 (IL10) și factorul de necroză tumorală α (TNF-α). Secvențele primare utilizate în test pot fi găsite în tabelul suplimentar 1. Metoda comparativă ddCt - a fost utilizată pentru a determina cantitatea de genă țintă normalizată la referințe endogene (GAPDH și RPL-10) și relativă la un calibrator utilizat în grupul de control.

Analiza genei ARNr 16S

Analize statistice

Toate analizele statistice pentru datele de secvențiere a ARNr 16S au fost efectuate în versiunea R 3.5.2 (33). Normalizarea scalării sumei totale a fost efectuată înainte de evaluarea diferențelor de impozitare la nivelul genului în cadrul grupurilor de tratament utilizând un test t permutare nepereche pe două fețe și corectat pentru comparație multiplă folosind procedura Benjamin Hochberg (FDR). Între grupul de tratament, analiza abundenței relative a fost evaluată folosind testul Kruskal Wallis și corectată cu FDR. Analiza permutațională multivariată a varianței (PERMANOVA) a fost utilizată pentru a evalua diferențele în diversitatea beta. Toate celelalte teste de semnificație au fost efectuate în Graphpad folosind fie t-testul Student, fie ANOVA cu Tukey post-hoc testare, cu P 0,05). În schimb, șoarecii cu deficit de vitamina B12 au prezentat cele mai semnificative modificări ale taxonilor, cu 39 de taxoni modificați semnificativ după expunerea la DSS (Cuvinte cheie FDR: vitamina B12, inflamație, microbiom, boală inflamatorie intestinală, colită

Citație: Lurz E, Horne RG, Määttänen P, Wu RY, Botts SR, Li B, Rossi L, Johnson-Henry KC, Pierro A, Surette MG și Sherman PM (2020) Deficitul de vitamina B12 modifică microbiota intestinală într-un model murin de Colită. Față. Nutr. 7:83. doi: 10.3389/fnut.2020.00083

Primit: 06 martie 2020; Acceptat: 07 mai 2020;
Publicat: 05 iunie 2020.

Silvia Turroni, Universitatea din Bologna, Italia

Nobuhiko Kamada, Universitatea din Michigan, Statele Unite
Ravinder Nagpal, Școala de Medicină Wake Forest, Statele Unite

† Adresa actuală: Eberhard Lurz, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Pediatrie, Dr. Spitalul de Copii von Hauner, Spitalul Universitar, LMU München, München, Germania

‡ Acești autori au împărtășit autorul co-primul