Domnule Wolff

1 DKFZ Junior Group Metabolism and Stem Cellity Plasticity, Centrul German de Cercetare a Cancerului, Heidelberg, Germania

extracelulare

A.E. Taranko

1 DKFZ Junior Group Metabolism and Stem Cellity Plasticity, Centrul German de Cercetare a Cancerului, Heidelberg, Germania

I. Meln

1 DKFZ Junior Group Metabolism and Stem Cellity Plasticity, Centrul German de Cercetare a Cancerului, Heidelberg, Germania

J. Weinmann

2 Spitalul Universitar Heidelberg, Departamentul de boli infecțioase/virologie, Centrul BioQuant, Heidelberg, Germania

T. Sijmonsma

3 Divizie Inflamare cronică și cancer, Centrul german de cercetare a cancerului (DKFZ), Heidelberg, Germania

S. Lerch

1 DKFZ Junior Group Metabolism and Stem Cellity Plasticity, Centrul German de Cercetare a Cancerului, Heidelberg, Germania

D. Heide

3 Divizie Inflamare cronică și cancer, Centrul German de Cercetare a Cancerului (DKFZ), Heidelberg, Germania

LA. Bilete

4 Departamentul de Chirurgie Generală, Viscerală și de Transplant, Universitatea din Heidelberg, Heidelberg, Germania

D. Tews

5 Divizia de Endocrinologie Pediatrică și Diabet, Departamentul de Pediatrie și Medicină pentru Adolescenți, Centrul Medical Universitar, Ulm, Germania

D. Krunic

Unitatea de microscopie cu 6 lumini, Centrul German de Cercetare a Cancerului (DKFZ), Heidelberg, Germania

P. Fischer-Posovszky

5 Divizia de Endocrinologie Pediatrică și Diabet, Departamentul de Pediatrie și Medicină pentru Adolescenți, Centrul Medical Universitar, Ulm, Germania

B.P. Müller-Stich

4 Departamentul de Chirurgie Generală, Viscerală și de Transplant, Universitatea din Heidelberg, Heidelberg, Germania

S. Herzig

7 Helmholtz Center München, Institutul pentru diabet și cancer IDC, Neuherberg, Germania

8 Program Heidelberg-IDC pentru diabet translațional, Spitalul Universitar Heidelberg, Heidelberg, Germania

D. Grimm

2 Spitalul Universitar Heidelberg, Departamentul de boli infecțioase/virologie, Centrul BioQuant, Heidelberg, Germania

9 Centrul german de cercetare a infecțiilor, site-ul partenerului Heidelberg, Germania

M. Heikenwälder

3 Divizie Inflamare cronică și cancer, Centrul german de cercetare a cancerului (DKFZ), Heidelberg, Germania

W.W. Ca

10 Departamentul de Oftalmologie, Universitatea din Cincinnati, Cincinnati, OH, SUA

A. Vegiopoulos

1 DKFZ Junior Group Metabolism and Stem Cellity Plasticity, Centrul German de Cercetare a Cancerului, Heidelberg, Germania

Abstract

Obiectiv

Remodelarea matricei extracelulare este necesară pentru expansiunea adiposului sub aport caloric crescut. La rândul său, expandabilitatea inhibată datorită depunerii aberante de colagen promovează rezistența la insulină și progresia către sindromul metabolic. Un rol emergent al micului proteican Glican bogat în leucină în boala hepatică grasă nealcoolică condusă metabolic suscită un interes în înțelegerea în continuare a rolului său în obezitatea indusă de dietă și complicațiile metabolice.

Metode

Ablația corpului întreg al genei Lumican (Lum -/-) și supraexpresia mediată de virusul adeno-asociat au fost utilizate în combinație cu dieta de control sau bogată în grăsimi pentru a evalua echilibrul energetic, homeostazia glucozei, precum și sănătatea și remodelarea țesutului adipos.

Rezultate

Lumican s-a dovedit a fi îmbogățit în mod special în celulele stromale izolate din țesutul adipos alb gonadal murin. De asemenea, grăsimea viscerală murină și umană a prezentat o creștere robustă a Lumican în comparație cu grăsimea din depozitul subcutanat. Șoarecii femele Lumican nuli au prezentat o creștere moderată a grăsimii, scăderea sensibilității la insulină și creșterea trigliceridelor hepatice într-o manieră dependentă de dietă. Aceste modificări au coincis cu inflamația țesutului adipos și nu au avut efecte evidente asupra expandabilității adipoase, adică formarea adipocitelor și hipertrofia. Expresia excesivă a lumicanului în grăsime viscerală și ficat a avut ca rezultat îmbunătățirea sensibilității la insulină și eliminarea glucozei.

Concluzii

Aceste date indică faptul că Lumican poate reprezenta o legătură funcțională între matricea extracelulară, homeostazia glucozei și caracteristicile sindromului metabolic.

1. Introducere

Expansiunea țesutului adipos în fața excesului caloric inițiază procese concomitente, inclusiv angiogeneza, inflamația și remodelarea matricei extracelulare (ECM) [1], [2]. Creșterea persistentă a grăsimii favorizează obezitatea, progresia către sindromul metabolic și diabetul de tip 2. Reglarea sensibilității la insulină ca factor patogen în sindromul metabolic reprezintă o țintă importantă care determină tratamentele terapeutice actuale și viitoare [1], [3], [4]. „Ipoteza expandabilității” sugerează că acumularea de grăsime în organele din afara țesutului adipos duce la moarte celulară, inflamație și rezistență la insulină, oferind o explicație pentru rezistența la insulină condusă de obezitate, precum și obezitatea sensibilă la insulină [4], [5], [ 6].

Remodelarea ECM în țesutul adipos necesită procese reciproce de depunere a proteinelor matriciale noi, în principal colageni, și descompunerea prin proteaze, cum ar fi metaloproteinazele matriciale (MMP) [4]. Mai mult, expresia modificată a colagenului poate îmbunătăți în mod direct sănătatea metabolică, așa cum sa raportat pentru masa corporală, sensibilitatea la insulină și trigliceridele hepatice la șoareci obezi obezi obezi obezi [7]. Micul proteican Glican (Lum), bogat în leucină, leagă colagenul și este asociat cu procesele de reparare în țesuturile conjunctive bogate în colagen [8], [9], [10]. Sa demonstrat că Lum se leagă direct de MMP și integrine, pentru a scădea activitatea MMP și a încetini progresia tumorii [11], [12]. Lum interacționează, de asemenea, cu celulele inflamatorii prin intermediul integrinelor și promovează diferențierea fibrocitelor atunci când este stimulat de factorul de necroză tumorală alfa (TNFα) [13], [14]. Rapoarte recente au implicat Lum ca un marker pentru progresia fibrotică în boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) și steatohepatita nealcoolică (NASH) [15], [16], [17]. La pacienții cu NAFLD și NASH, rata de sinteză fracțională a colagenului hepatic, care este un corelat stabilit al progresiei bolii fibrotice, corelată cu creșterea nivelurilor plasmatice de Lum, sugerând că Lum ar putea fi dezvoltat ca instrument de diagnosticare pentru măsurarea fibrozei hepatice și a stadializării NAFLD/NASH [16].

Deși Lum a fost conectat la fibroză [18], [19], funcția imună [13], [14], [20] sau progresia cancerului [11] și a fost chiar implicat ca biomarker în boala hepatică determinată de obezitate [ 21], rolurile sale în dezvoltarea obezității și sindromul metabolic nu au fost explorate. Rezultatele preliminare din analiza microarray au arătat că ARNm Lum a fost exprimat diferențial în țesutul adipos alb de șoareci hrăniți cu dietă bogată în grăsimi (HFD) (rezultate nepublicate). Am decis să explorăm impactul pierderii Lum (Lum-Ko, șoareci nuli ai corpului total) și a supraexprimării Lum (OE) asupra metabolismului și cantității și calității țesutului adipos. În acest studiu, am expus șoareci masculi și femele la HFD și am observat un efect specific sexului asupra acumulării de grăsime la șoarecii femele Lum-Ko care au coincis cu inflamația crescută și rezistența la insulină. La fel, Lum-OE în grăsimea viscerală și ficatul au îmbunătățit clearance-ul glucozei și sensibilitatea la insulină. Împreună, aceste rezultate sugerează un rol al Lum în homeostazia sistemică a glucozei și dezvoltarea complicațiilor metabolice asociate cu obezitatea.

2. Materiale și metode

2.1. Animale și modele experimentale

Șoarecii Lumican nuli (Lum-Ko) provin din Kao Lab de la Universitatea din Cincinnati, (Cincinnati, OH, SUA) [22], iar șoarecii C57BL/6 au fost cumpărați de la Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germania) la 4-5 săptămâni de varsta. Șoarecii au fost adăpostiți la temperatura camerei cu un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore pe dieta de control (Dietele de cercetare, New Brunswick, NJ, SUA, D12450j) sau dieta bogată în grăsimi (60% kcal din grăsimi, Dietele de cercetare, D12492) timp de 3, 8 sau 10 săptămâni, după cum este indicat. Șoarecii au fost găzduiți în grupuri de 2–3 animale cu acces ad libitum la hrană și apă. EchoMRI a fost utilizat pentru măsurarea compoziției corpului (Echo Medical Systems, Houston, TX, SUA). La încheierea studiului, țesuturile au fost congelate rapid pentru analiză sau plasate în histofix (formaldehidă, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania). Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu directivele Uniunii Europene și cu legea germană privind bunăstarea animalelor (Tierschutzgesetz) și au fost aprobate de autoritățile locale (Regierungspräsidium Karlsruhe).

2.2. TSE PhenoMaster

Consumul de oxigen (calorimetrie indirectă), aportul de alimente și măsurători ale activității locomotorii au fost efectuate pentru șoareci găzduiți individual la 22 ° C în sistemul PhenoMaster Home Cage System (sistem TSE, Bad Homburg, Germania). Cheltuielile totale de energie (TEE) au fost calculate utilizând ecuația Weir unde rata metabolică (kcal/zi) = 1,44 (3,94 × VO2 + 1,11 × VCO2) [23].

2.3. Insulina serică, trigliceridele hepatice, HOMA-IR, GTT/ITT

Nivelurile serice de insulină au fost determinate de ELISA Kit (80-INSMS-E01-AL, ALPCO, Salem, NH, SUA) conform protocolului producătorului și cititorului de microplăci Mithras (Berthold Technologies GmbH & Co, Bad Wildbad, Germania). Concentrația a fost calculată pe baza seriilor standard de diluare utilizând resursa web a analizei Elisa (http://www.elisaanalysis.com/). Glicemia a fost determinată cu un glucometru Accu-Check (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). HOMA-IR a fost calculat utilizând formula: HOMA-IR (mmol l-1 × μU ml-1) = glucoză din sânge în post (mmol l-1) × insulină serică de post (μU ml-1) /22,5. Trigliceridele hepatice și musculare au fost extrase așa cum s-a descris anterior [24] și determinate cu Serum Triglyceride Determination Kit (TR0100, Sigma Aldrich, München Germania) și Mithras Microplate Reader (Berthold Technologies GmbH & Co, Germania). Testul de toleranță la insulină (ITT) și testul de toleranță la glucoză (GTT) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [25].

2.4. Imunofluorescență/imunohistochimie

Pentru lamele de colorare F4/80 și Cd11c au fost prelucrate așa cum s-a raportat anterior [27] folosind BondMax (Leica Biosystems, Wetzlar, Germania), anticorp α-F4/80 de șobolan (diluat 1: 120, Linaris Biologische Produkte GmbH, Dossenheim, Germania, # 13422.00500), hamster α-Cd11c (diluat 1: 5000, BD Bioscience, Heidelberg, Germania, # 553799) și anticorpi 2 ° conjugați cu HRP (1: 1000) cu contracolorare hematoxilină. Imaginile au fost achiziționate folosind microscopul Zeiss Axioplan cu setări și timpi de achiziție identici pentru toate probele. Celulele pozitive F4/80 și structurile asemănătoare coroanei (CLS) au fost calculate în medie din 10 secțiuni de imagini independente, numărate orbește. Colorarea cu roșu Picro-Sirius a fost efectuată pe un aparat de colorat Leica (model # ST5020). După rehidratare și clătire, lamele au fost colorate cu roșu Pikro-Sirius (Morphisto GmbH, Viena, Austria) timp de 60 de minute și deshidratate. Imaginile au fost achiziționate folosind microscopul Uissight Zeiss Axiophot cu setări identice și timpi de achiziție pentru toate probele.

2.5. Subiecți umani

Biopsiile de grăsime subcutanată abdominală umană și grăsime viscerală omentală au fost colectate în timpul intervenției chirurgicale bariatrice la Departamentul de Chirurgie, Spitalul Universitar Heidelberg, cu aprobarea Comitetului de revizuire instituțională a Facultății de Medicină a Universității din Heidelberg, în conformitate cu declarația de la Helsinki și a acesteia. amendamentele ulterioare. Consimțământul informat preoperator a fost obținut de la toți pacienții pentru utilizarea probelor. Biopsiile au fost înghețate instantaneu la colectare. Vârsta medie a pacienților a fost de 49 de ani, IMC> 30, n = 11 femei și n = 10 bărbați au fost evaluate în acest studiu.

Pentru izolarea celulară, țesutul adipos mamar a fost obținut de la n = 5 femei supuse unei intervenții chirurgicale plastice (IMC mediu 31,2 kg/m 2, interval 24,8-36,0; vârstă medie 46,6 ani; interval 20-65). Studiul a fost aprobat de comitetul etic al Universității Ulm (vot nr. 300/16) și toți pacienții au dat consimțământul scris în scris. Celulele au fost izolate prin digestii colagenazice așa cum este descris [28]. Adipocitele și celulele stromal-vasculare (SVC) au fost separate prin centrifugare.

2.6. Izolarea ARN și analiza qRT-PCR

ARN-ul a fost extras din țesuturi înghețate rapid folosind QIAZOL (QIAGEN, Hilden, Germania) și kitul micro RNeasy (QIAGEN), inclusiv tratamentul cu DNază sau kitul Direct-zol RNA Miniprep (grăsime mamară umană, Zymo Research, Freiburg, Germania) după protocolul producătorului. Sinteza ADN-ului complementar (ADNc) a fost efectuată cu ajutorul ARN-ului folosind QuantiTect_ Reverse Transcription Kit (Qiagen). Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR) a fost efectuată utilizând teste de expresie genică TaqMan (Life Technologies, Darmstadt, Germania) și TaqMan Gene Expression Master Mix pe un sistem StepOnePlus ™ PCR în timp real (tehnologii de viață). Analiza ARN-ului derivat din grăsimi mamare a fost efectuată cu Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad, München, Germania) pe un ciclator CFX Connect qPRC (BioRad) cu grunduri personalizate pentru LUM (forward-TAACTGCCCTGAAAGCTACCC, reverse GGAGGCACCATTGGTACACTT) și T -TGGGATGG, invers TCCTGTGCCCTT GCCAATCATGGTAGAC). Expresia relativă a fost calculată utilizând metoda ΔΔCT cu normalizare la Tbp/TBP (proteină de legare a cutiei TATA), ARNr 18S (pancreas) sau TF2B (grăsime mamară).

2.7. Western blot

Proteinele au fost extrase cu tampon RIPA cu inhibitori de protează și fosfatază (Sigma - Aldrich), separați prin SDS-PAGE (10%) și s-au șters pe membrane de nitroceluloză (0,45 μM, BioRad, SUA) cu un sistem de rezervor de umezire umedă BioRad. Bloturile au fost supuse blocării cu 5% BSA și incubării peste noapte la 4 ° C cu iepure α-Lumican (1: 1000, R&D Systems Minneapolis, MN, SUA, # AF2745), șobolan α-Cd11c (1: 1000, R&D Systems, # MAB11241) sau mouse-ul α-Vcp (1: 5000, clona 5, nr. Cat. Ab11433, Abcam, Marea Britanie), urmat de anticorpi 2 ° conjugați cu HRP, reactiv ECL Select Western Blot (GE Healthcare Life Sciences, SUA) ) și imagistică utilizând ChemiDoc XRS + (BioRad, SUA).

2.8. Izolarea și diferențierea celulelor progenitoare adipoase

2.9. Vectorii de virus adeno-asociați

pSSV9-CAG-Lum (AAV-Lum) a fost donat prin inserarea unui fragment EcoRI-NotI din pCMV6-Lum (Origene/Biocat, Heidelberg, Germania, # MC207318-OR) conținând secvența completă de codare a mouse-ului Lum, în coloana vertebrală pSSV9 [31] conținând elementul stimulator CMV/promotor beta-actină de pui (CAG). Vectorul de control AAV-GFP conținea secvența de codificare GFP în locul secvenței Lum. Pentru producerea de AAV recombinante, celulele HEK293T au fost transfectate triplu cu 1) vectorul pSSV9, 2) plasmida de ajutor p5E18-VD2/8mut6 conținând AAV2 rep și regiunea mutantă AAV8 genele cap 6 [32], precum și 3) Plasmida de ajutor adenoviral pDG adVP folosind polietilenimină ca reactiv de transfecție. Celulele au fost colectate prin răzuire și centrifugare, lizate prin îngheț/dezgheț și tratate cu benzonază particulele AAV au fost purificate printr-un gradient de densitate de iodixanol așa cum s-a descris anterior [33]. Fracția de iodixanol care conține vector AAV a fost dializată și concentrată cu un tub Amicon Ultra-15.