Aaron J. Polichnowski

1 Departamentul de Medicină, Universitatea Loyola și Hines Veterans Affairs Hospital, Maywood, Illinois;

Hector Licea-Vargas

1 Departamentul de Medicină, Universitatea Loyola și Hines Veterans Affairs Hospital, Maywood, Illinois;

Maria Picken

3 Departamentul de patologie, Universitatea Loyola, Maywood, Illinois

Jianrui Long

2 Departamentul de Inginerie Electrică și Calculatoare, Institutul de Tehnologie din Illinois, Chicago, Illinois; și

Rashmi Bisla

1 Departamentul de Medicină, Universitatea Loyola și Hines Veterans Affairs Hospital, Maywood, Illinois;

Geoffrey A. Williamson

2 Departamentul de Inginerie Electrică și Calculatoare, Institutul de Tehnologie din Illinois, Chicago, Illinois; și

Anil K. Bidani

1 Departamentul de Medicină, Universitatea Loyola și Hines Veterans Affairs Hospital, Maywood, Illinois;

Karen A. Griffin

1 Departamentul de Medicină, Universitatea Loyola și Hines Veterans Affairs Hospital, Maywood, Illinois;

Abstract

Modelul obezității induse de dietă (DIO) este frecvent utilizat pentru a examina patogeneza patologiilor legate de obezitate; cu toate acestea, numai glomeruloscleroza minimă (GS) a fost raportată după 3 luni. Am investigat dacă GS se dezvoltă pe perioade mai lungi de DIO și am examinat rolul potențial al mecanismelor hemodinamice în patogeneza sa. Șobolanilor cu vârste de opt săptămâni, predispuși la obezitate (OP) și rezistenți la obezitate (OR) (Charles River) li s-a administrat o dietă moderat bogată în grăsimi timp de 5 luni. Au fost evaluate tensiunea arterială, proteinuria și GS măsurate radiotelemetric. Șobolanii OP (n = 10) au dezvoltat hipertensiune arterială modestă (142 ± 3 vs. 128 ± 2 mmHg, P 3 × 10 −6) au fost similari între șobolanii OP (n = 6) și OR (n = 9). Autoreglarea fluxului sanguin renal a fost păstrată atât la șobolani OP (n = 7), cât și la OR (n = 7). În schimb, administrarea esterului metilic N-it-nitro-l-arginină (l-NUME) la șobolani conștienți, cu instrumente cronice OP (n = 11) a dus la creșteri cu 15% și 39% ale tensiunii arteriale și, respectiv, rezistenței vasculare renale și o scădere cu 16% a fluxului sanguin renal. Efectele minime ale l -NAME au fost observate la șobolani OR (n = 9). Pe scurt, GS asociat DIO este precedat de o sensibilitate hemodinamică crescută la l -NAME dar nu hipertrofie renală sau hiperfiltrare.

METODE

Animale

Șobolani masculi OP și OR Sprague-Dawley au fost achiziționați la vârsta de 6-8 săptămâni de la Charles River, unde au fost menținuți ca colonii separate și au fost hrăniți cu o dietă standard de chow. Așa cum s-a descris anterior (58), aceste colonii de șobolani OP și OR au fost derivate dintr-o linie de șobolani Sprague-Dawley de la râul Charles printr-o reproducere selectivă pe baza fenotipului de creștere în greutate în timpul consumului unei diete bogate în energie. Toți șobolanii au fost hrăniți cu o dietă standard de chow (13% kcal din grăsimi, 1% NaCl, LabDiet 5001) la sosirea la Hines Veterans Affairs Hospital. După măsurătorile inițiale, dieta a fost trecută la o dietă MHF (32% kcal din grăsimi, 0,5% NaCl, Research Diets D12266B) pe durata experimentelor. Apa a fost furnizată ad libitum. Toate animalele au fost îngrijite în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și toate protocoalele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor Hines Veterans Affairs.

Proceduri experimentale

Au fost efectuate patru experimente în grupuri separate de șobolani OP și OR. Experimentul 1 a examinat efectul administrării prelungite (5 luni) a unei diete MHF asupra tensiunii arteriale măsurate prin radiotelemetrie (TA) și a leziunilor renale. Experimentele 2-4 au fost efectuate după 3 luni de administrare a unei diete MHF, înainte de dezvoltarea unei leziuni renale substanțiale (26), pentru a caracteriza mecanismele hemodinamice antecedente potențiale ale leziunii renale asociate obezității, care au inclus 1) rata de filtrare glomerulară (GFR) măsurători la șobolani conștienți și volumul glomerular determinat morfometric asociat, 2) capacitatea de autoreglare a fluxului sanguin renal la starea de echilibru (RBF) după modificările pasului BP la șobolanii anesteziați și 3) Relațiile BP-RBF și autoreglarea dinamică a RBF înainte și în timpul administrarea de ester metilic N-nitro-l-arginină (l-NUME) la șobolani conștienți.

Experimentul 1: Răspunsurile la TA și leziuni renale după 5 luni de hrănire cu MHF.

Experimentul 2: GFR ambiental și volumul glomerular după 3 luni de alimentare cu MHF.

Șobolanii OP (n = 6) și OR (n = 9) hrăniți cu dieta MHF timp de 3 luni au fost anesteziați [pentobarbital sodic (50 mg/kg ip)] și o minipompă osmotică (2ML1, Durect, Cupertino, CA) conținând 10 mg/ml FITC-inulină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dizolvată în 10 mM PBS (pH 7,4) a fost implantată chirurgical (subcutanat) în regiunea subscapulară pentru determinarea GFR în starea conștientă, similar cu metodele anterioare descris de alții (15, 59). La trei zile după operație, șobolanii au fost plasați în cuști metabolice și s-au obținut o recoltare de urină 24 de ore și o probă de sânge din vena cozii. După recoltarea de urină 24 de ore, șobolanii au fost anesteziați, iar rinichii au fost perfuzionați pentru analiza morfometrică.

Experimentul 3: autoreglare renală în starea de echilibru după 3 luni de hrănire cu MHF.

Șobolanii OP (n = 7) și OR (n = 7) hrăniți cu dieta MHF timp de 3 luni au fost anesteziați [inactină (100 mg/kg ip)] și pregătiți chirurgical pentru evaluarea capacității de autoreglare renală, așa cum s-a descris anterior (11, 14, 36, 37, 39, 40). Indicii de autoreglare au fost calculați ca variație fracțională în RBF/variație fracțională TA, așa cum s-a descris anterior (1, 11, 14, 36, 37, 39, 40).

Experimentul 4: hemodinamica renală ambientală și autoreglare dinamică după 3 luni de hrănire cu MHF.

Șobolanii OP (n = 11) și OR (n = 9) hrăniți cu dieta MHF timp de 3 luni au fost anesteziați [pentobarbital sodic (50 mg/kg ip)] și au fost instrumentați cronic cu un transmițător radiotelemetric BP și o sondă Transonic RBF pe stânga artera renală, așa cum s-a descris anterior (1, 11, 34, 35, 37). După 7 zile de recuperare după operație, înregistrările inițiale (2-4 ore la 200 Hz) ale TA și RBF au fost făcute la șobolani conștienți. După una până la trei dintre aceste înregistrări la intervale de 24 de ore, l -NAME a fost administrat în apă potabilă la o doză de 100 mg/l (~ 10 mg · kg -1 = zi -1). Începând cu cel puțin 48 de ore după inițierea l -NAME, s-au obținut din nou înregistrări BP și RBF. După 4-6 zile și două până la trei astfel de înregistrări, doza de l -NAME a fost crescută la 250 mg/l (∼25 mg · kg -1 -1 zi -1), iar înregistrările BP și RBF au fost obținute într-un studiu similar manieră. Rezultatele medii ale celor două sau trei înregistrări separate de 2 până la 4 h ale BP și RBF la fiecare șobolan înainte și în timpul ambelor doze de administrare de l -NAME au fost utilizate pentru a caracteriza hemodinamica renală de bază și efectele l -NAME asupra acestor măsurători.

Metode histologice și morfometrice

Secțiunile transversale (3 μm) ale rinichilor încorporați cu parafină au fost colorate cu hematoxilină și eozină și acid periodic Schiff pentru analize histologice. Leziunea glomerulară a fost cuantificată într-o manieră orbită ca procentaj total de glomeruli (cel puțin 100 glomeruli/secțiune) care prezintă leziuni ale GS segmentar sau global, așa cum s-a descris anterior (9, 34-37, 39, 40). Aria secțiunii transversale glomerulare a fost măsurată utilizând software-ul Image-Pro Premier de analiză a imaginii (versiunea 9.0, MediaCybernetics, Rockville, MD) folosind un obiectiv obiectiv × 20 pe un microscop DMCD Leica (Wetzlar, Germania) echipat cu o cameră digitală Leica DFC295 în secțiuni periodice colorate cu acid-Schiff, așa cum s-a descris anterior (39-41). Aria secțiunii transversale glomerulare a 100 glomeruli/secțiune renală a fost evaluată de doi indivizi ale căror valori au fost apoi mediatizate. Volumul glomerular mediu a fost calculat după cum urmează: volumul glomerular = β/κ (AG 3/2), unde AG este aria secțiunii transversale glomerulare, β este coeficientul de distribuție a dimensiunii (egal cu 1,38), iar κ este coeficientul de formă pentru glomeruli idealizat ca sfere (egal cu 1,1) (62, 79).

Determinarea GFR

Standardele FITC-inulină au fost realizate dintr-o soluție de 10 mg/ml FITC-inulină prin diluare în serie în tampon HEPES 10 mM (pH 7,4, Sigma-Aldrich) în concentrații cuprinse între 0,15 și 20 μg/ml. Probele de urină au fost prediluate în tampon HEPES (1: 100), iar probele, plasma și urina prediluată au fost apoi diluate în continuare în tampon HEPES (1:39). Standardele, probele și golul (tampon HEPES) au fost rulate în triplicat (200 μl/godeu) pe o microplacă neagră cu 96 de godeuri (Costar). Plasma și urina de la șobolani care nu au fost perfuzați cu FITC-inulină au fost incluse pentru a corecta diferențele de fluorescență de fond. Fluorescența a fost măsurată folosind un cititor de microplacă fluorescentă (Synergy HT, BioTek, Winooski, VT) cu filtre de excitație și de emisie de 485 și respectiv 530 nm. GFR a fost calculat prin împărțirea ratei de excreție a FITC-inulinei la concentrația sa plasmatică.

Autoreglare dinamică RBF

Analiza funcției de transfer între BP (intrare) și RBF (ieșire) a fost efectuată la momentul inițial și la ambele doze de l -NAME folosind metode publicate anterior (1, 11, 34, 35, 37, 66). Frecvențele naturale ale mecanismelor de feedback miogen și tubuloglomerular au fost determinate din vârfurile caracteristice ale rezonanței semnăturii lor în câștigul fracțional în admisie între 0,1 și 0,3 Hz și între 0,025 și 0,05 Hz, respectiv, prin inspecția înregistrărilor individuale și mediat în fiecare înregistrare. Am folosit alte câteva componente ale analizelor funcției de transfer care au fost considerate indici potențiali ai puterii mecanismului miogen renal, inclusiv 1) panta de reducere a magnitudinii admiterii imediat sub vârful miogen, 2) faza de vârf asociată cu frecvența vârful de rezonanță al semnăturii mecanismului miogen și 3) coerența medie între 0,5 și 1 Hz (34, 66).

Analize statistice

Valorile sunt mijloace ± SE; n = 10 șobolani predispuși la obezitate (OP) și 8 șobolani rezistenți la obezitate (OR). MHF, dieta moderat bogată în grăsimi.

obezității

A - C: nu au existat diferențe semnificative în greutatea rinichilor (A), rata de filtrare glomerulară (GFR; B) sau volumul glomerular (C) observate între șobolanii OP și OR după 3 luni de administrare a unui moderat bogat în grăsimi (MHF) dietă. D: s-a observat o corelație semnificativă între GFR și volumul glomerular la șobolanii OP și OR. Valorile sunt exprimate ca medii ± SE.

Autoreglare renală în starea de echilibru la șobolani A administrat dieta MHF timp de 3 luni

Aceste experimente au fost efectuate pentru a examina capacitatea vasculaturii renale de a tampona modificări mari la starea de echilibru ale presiunii arteriale medii (MAP) sub anestezie, care oferă cel mai bun indice de susceptibilitate la afectarea renală indusă de hipertensiune (11). La 3 luni de administrare a dietei MHF, greutatea corporală a șobolanilor OP (n = 7) a fost semnificativ (P l-NUME la șobolanii conștienți a administrat dieta MHF timp de 3 luni

masa 2.

Funcții de transfer legate de mecanismele de autoreglare a feedbackului miogen și tubuloglomerular înainte și după administrarea l -NAME la șobolani conștienți OP și OR, hrăniți cu dieta MHF timp de 3 luni

Feedback tubuloglomerular miogen Frecvență, Hz Câștig fracțional Pic de fază, ° Coerență la 0,05-0,1 Hz Panta reducerii câștigului, db/deceniu Frecvență, Hz Câștig fracțional
Șobolani OP
De bază0,26 ± 0,012,0 ± 0,2113 ± 110,5 ± 0,0526 ± 30,04 ± 0,0020,4 ± 0,1
l -NUME0,24 ± 0,012,4 ± 0,2126 ± 60,5 ± 0,0630 ± 30,04 ± 0,0030,5 ± 0,1
SAU șobolani
De bază0,23 ± 0,012,3 ± 0,292 ± 60,5 ± 0,0329 ± 20,04 ± 0,0030,5 ± 0,1
l -NUME0,21 ± 0,013,6 ± 0,6 * † 116 ± 130,4 ± 0,0437 ± 50,03 ± 0,0020,5 ± 0,1
Efecte ANOVA
ÎncordareP l -NUMEValorile esterului metilic P ω-nitro- l-arginină (l-NUME) reprezintă media valorilor funcției de transfer la dozele de 100 și 250 mg/l de l-NUME, care nu au fost semnificativ diferite între ele în cadrul OP și OR șobolani. NS, nu semnificativ.

DISCUŢIE

Pe scurt, aspectele noi ale acestui studiu includ 1) demonstrația că GS substanțial se dezvoltă în tulpina OP a modelului DIO, 2) dezvoltarea unor astfel de GS legate de obezitate are loc în absența hipertrofiei și hiperfiltrării glomerulare și 3) sensibilitatea hemodinamică crescută la administrarea l -NAME precede dezvoltarea GS legate de obezitate la șobolanii OP. Aceste date au implicații foarte importante cu privire la rolul potențial al scăderii NO în patogeneza GS în acest model DIO.

SUBVENȚII

Această lucrare a fost susținută de Oficiul de Cercetare și Dezvoltare al Departamentului pentru Afaceri ale Veteranilor Premiul pentru Dezvoltarea Carierei 1IK2BX001285 (către AJ Polichnowski) și un Premiu pentru Revizuirea Meritului (pentru KA Griffin) și de către Institutul Național pentru Diabet și Subvenții Digestive și pentru Boli Renale DK -40426; (către A. K. Bidani) și DK-61653 (către K. A. Griffin).

DIVULGĂRI

Niciun conflict de interese, financiar sau de altă natură, nu este declarat de autor (i).