Conectați-vă folosind numele de utilizator și parola

Meniu principal

Conectați-vă folosind numele de utilizator și parola

Esti aici

  • Acasă
  • Arhiva
  • Volumul 42, numărul 3
  • Helicobacter pylori este ucis de nitrit în condiții acide

  • Articol
    Text
  • Articol
    info
  • Citare
    Instrumente
  • Acțiune
  • Răspunsuri
  • Articol
    valori
  • Alerte
  1. R S Dykhuizen a,
  2. A Fraser b,
  3. H McKenzie c,
  4. M Golden a,
  5. C Leifert d,
  6. N Benjamin e
  1. a Departamentul de Medicină și Terapeutică, Școala Medicală, Forresterhill, Aberdeen AB9 2ZB, Marea Britanie, b Departamentul de Gastroenterologie, Aberdeen Royal Infirmary NHS Trust, c Departamentul de Microbiologie Medicală, Universitatea din Aberdeen, d Soil Science Institute, Universitatea din Aberdeen, e Departamentul de farmacologie clinică, St Bartholomew și Royal London Hospital School of Medicine and Dentistry
  1. Dr. Dykhuizen.

Abstract

Context - Datorită expresiei ureazei, Helicobacter pylori este capabil să se stabilească în stomacul uman în condiții acide. Un nou mecanism de apărare a gazdei a fost propus recent, sugerând că formarea nitriților salivari în simbioză cu bacteriile anaerobe facultative din orofaringe, vizează îmbunătățirea activității antimicrobiene a sucului gastric.

este

Obiective - Să investigheze dacă adăugarea de nitriți în concentrații fiziologice influențează rezistența H pylori la acid.

Metode - H pylori cultivat din probe de biopsie gastrică proaspătă a fost expus timp de 30 de minute la soluție salină normală și la tampon HCI/KCl (0,2 M) la pH 2 cu uree (5 mM) adăugată. S-a determinat influența azotitului de potasiu (50-1000 μmol/l) asupra supraviețuirii bacteriene.

Rezultate - Adăugarea de nitriți (1 mM) la soluțiile acide (pH 2) a dus la distrugerea completă a H pyloriwithin timp de expunere de 30 de minute, în timp ce acidul singur a permis organismului să supraviețuiască (p

Statistici de pe Altmetric.com

Helicobacter pylori este cel mai comun agent patogen la nivel mondial și peste jumătate din populația lumii de peste 40 de ani este colonizată.1 Provoacă gastrită cronică activă și este asociată cu ulcer duodenal și gastric și malignitate gastrică.2, 3

Majoritatea agenților patogeni bacterieni ingerați nu dau naștere niciodată colonizării tractului gastro-intestinal din cauza barierei acidului gastric.4 H pylori sintetizează însă o enzimă urează care creează un mediu alcalin pentru a proteja organismul de efectul bactericid al acidului.5, 6

Lucrările recente din laboratoarele noastre au sugerat un nou mecanism de apărare a gazdei în tractul gastro-intestinal superior al mamiferelor. Am arătat generarea de nitriți salivați în gură printr-o relație simbiotică cu bacteriile anaerobe facultative de pe suprafața limbii după ingestia nitratului alimentar.7-10 Adăugarea de nitriți la soluțiile acide in vitro realizează distrugerea agenților patogeni intestinali umani, în timp ce acidul singur permite creșterea continuă.11, 12 Am sugerat că înghițirea salivei bogate în nitriți după o masă bogată în nitrați poate spori apărarea gazdei împotriva agenților patogeni ingerați.

În lucrarea de față raportăm efectul antimicrobian al nitritului acidificat asupra H pylori in vitro. Supraviețuirea organismelor a fost studiată după expunerea la soluții testate cu acid singur, acid plus uree și acid plus uree și nitriți. A fost determinată dependența de doză a acțiunii antibacteriene a nitriților la pH 2.

Metode

PREGĂTIREA INOCULATULUI

H pylori, izolat din specimene de biopsie gastrică umană, a fost cultivat pe plăci de agar din sânge de cal incubate la 37 ° C într-o atmosferă de 10% CO2, 5% oxigen și 85% azot („campygas”). După trei zile de incubație, bacteriile au fost recoltate și suspendate în soluție salină normală la pH 7 pentru a da o concentrație finală de aproximativ 109 celule/ml (turbiditate = McFarland’s no 6).

EFECTUL EXPUNERII H PILORULUI LA ACID, UREA ȘI NITRIT

S-a adăugat inoculat (1 ml) la 4,5 ml tampon HCI/KCI 0,2 M la pH 2 cu sau fără uree (5 mM) în soluție. Imediat după aceea, s-au adăugat soluții saline normale (1 ml) sau nitrit de potasiu (1 ml) pentru a atinge o concentrație finală de 1 mmol/l în recipiente universale. Ca martor, experimentul a fost repetat cu 4,5 ml soluție salină normală la pH 7 în loc de 0,2 M tampon HCI/KCl.

Probele au fost incubate la 37 ° C. După 30 de minute, alicote din fiecare probă au fost diluate cu ser fiziologic normal în diluții seriale de 10 ori pentru a determina numărul de unități care formează colonii (ufc). Suspensiile diluate (10 μl) au fost inoculate pe plăci de agar din sânge de cal și incubate într-un incubator anaerob cu 5% CO2 timp de până la cinci zile. Numărul de colonii pe placă a fost calculat astfel: numărul de colonii × [1/diluție] × [1/0,01] pe ml. Limita inferioară de detectare a fost de 10 2 organisme/ml.

RELAȚIA DOZEI EFECTULUI ANTIMICROBIAN AL NITRITEI PE PILORI LA pH 2

S-a adăugat inoculat (1 ml) la 4,5 ml tampon HCI/KCI 0,2 M la pH 2 cu 5 mM uree în soluție. Imediat după aceea, s-a adăugat o soluție de nitrit de potasiu (1 ml) pentru a atinge concentrațiile finale de 0, 50, 100, 200, 500 și 1000 μmol/l. Ca martor, experimentul a fost repetat cu 4,5 ml soluție salină normală la pH 7 în loc de 0,2 M tampon HCI/KCl la pH 2.

Recipientele au fost incubate la 37 ° C. După 30 de minute, s-au prelevat probe din fiecare recipient și s-au diluat cu soluție salină normală în diluții seriale de 10 ori pentru determinarea UFC. Suspensiile diluate au fost inoculate pe plăci de agar din sânge de cal și incubate într-un incubator anaerob cu 5% CO2 timp de până la cinci zile. Numărul de colonii pe placă a fost calculat astfel: numărul de colonii × [1/diluție] × [1/0,01] pe ml. Limita inferioară de detectare a fost de 10 2 organisme/ml.

PH-ul din recipientele universale a fost măsurat cu un electrod de pH din sticlă înainte și după fiecare incubare de 30 de minute de H pylori în azotit acidificat. Experimentele au fost realizate în trei exemplare.

Rezultate

Tabelul 1 prezintă efectele expunerii la H pylori la acid, uree și nitriți. Experimentele de control au arătat aproximativ 5 × 106 cfu/ml după 30 de minute de expunere la pH 7 în recipientele universale; s-a observat o rată de supraviețuire similară când a fost prezent 1 mM nitrit de potasiu. De asemenea, organismele au reușit să supraviețuiască, deși în număr mai mic, după expunerea la pH 2 în prezența ureei. Cu toate acestea, adăugarea de 1 mM nitrit de potasiu la pH 2 plus uree a dus la uciderea completă (p Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Supraviețuirea H pylori (log cfu/ml (SD)) după expunerea la acid (pH 2), uree (5 mmol/l) și nitrit de potasiu (1 mmol/l)

Figura 1 arată că efectul antimicrobian al nitriților este dependent de doză. Creșterea uciderii a fost observată după adăugarea de 0,05 și 0,1 mM de nitrit în toate cele trei experimente. Deși s-a folosit același izolat, inoculul din prima serie părea mult mai sensibil la mecanism decât cele din celelalte două serii. Nu a fost detectată nicio supraviețuire în prima serie la concentrații de ± 0,2 mmol/l, iar în celelalte două serii la ± 0,5 mmol/l. Diferența de sensibilitate a inoculatelor se datorează cel mai probabil diferențelor de viabilitate, care au fost de asemenea evidente atunci când inoculații au fost expuși la acid singuri timp de 30 de minute. În timp ce 1 × 106 cfu/ml au fost recuperați după ce inoculul 1 a fost expus la soluție salină normală la pH 7, doar 3 × 104 cfu/ml au supraviețuit după expunerea la tampon HCl/KCl la pH 2, ceea ce a ucis 97% din organisme numai datorită acidului. Aceste cifre au fost de 3 × 105 la pH 7 față de 1 × 105 la pH 2 pentru al doilea și 1 × 106 la pH 7 față de 4 × 105 la pH 2 pentru al treilea inocul, reprezentând ucideri de numai 60-70 % din organisme datorită adăugării de acid.

Activitatea antibacteriană a nitriților împotriva H pylori la pH 2 după 30 de minute de expunere. Experimentele au fost efectuate în triplicat (seria 1, 2 și 3). Nu a fost detectată nicio supraviețuire la concentrații de nitriți ⩾500 μmol/l.

PH-ul a fost 2 în toate recipientele universale la începutul expunerii. O creștere a pH-ului a fost observată la sfârșitul timpului de expunere în acele recipiente în care s-a observat supraviețuirea H pylori. PH-ul de la sfârșitul experimentelor în raport cu numărul de organisme supraviețuitoare este reprezentat în fig 2.

pH-ul în recipiente universale la sfârșitul experimentului comparativ cu numărul de H pylori supraviețuitori (pH inițial = 2 în toate experimentele).

Discuţie

Experimentul, rezumat în tabelul 1, a arătat o supraviețuire bună la pH 7. Nu a fost observat niciun efect antibacterian al adăugării de 1 mM nitrit de potasiu la acest pH. H pylori au fost uciși la pH 2, cu excepția cazului în care ureia a fost prezentă în soluție. Hidroliza ureei în amoniac și bicarbonat mediată de uree bacteriană neutralizează ionii de hidrogen care pătrund în peretele celular6: Cu toate acestea, chiar și în prezența ureei, organismul părea să nu poată supraviețui atunci când s-a adăugat 1 mM nitrit la mediu. Figura 1 prezintă relația (negativă) dependentă de doză între nitriți și numărul de microorganisme supraviețuitoare la pH 2.

Acidificarea nitriților a generat intermediari reactivi ai azotului care au proprietăți citotoxice: oxidul nitric inhibă enzimele lanțului respirator prin inactivarea complexelor de fier-sulf, 13 și perturbă replicarea ADN prin inhibarea ribonucleotid reductazei. de microorganisme15, precum și pentru celulele tumorale.16 Cu toate acestea, experimentele cu compuși donatori de NO au arătat o activitate antibacteriană redusă de NO în sine, 17 și efectele sale toxice sunt mai susceptibile de a fi realizate prin formarea peroxinitritului în prezența superoxidului, 18 generarea dependentă de oxigen a radicalului de dioxid de azot atunci când concentrațiile de oxid azotic sunt mari, 19 și/sau specii de azot încă necaracterizate.20 Se pare cel mai probabil că activitatea antibacteriană a nitriților acidificați se datorează unei contribuții aditive a intermediarilor reactivi ai azotului. 21

În plus față de incertitudinea cu privire la identitatea intermediarului (reactivilor) reactiv (e) de azot responsabil pentru activitatea antimicrobiană observată, datele din această lucrare lasă loc interpretării că uciderea H pylori de azotit acidificat nu se datorează acțiunii antibacteriene pe dar este doar un rezultat al inhibării enzimei ureazei. Demonstrarea activității antimicrobiene a nitriților acidificați împotriva altor agenți patogeni intestinali care sunt ureazi negativi, 12 și împotriva drojdiei Candida albicans, 11 oferă sprijin pentru o acțiune antibacteriană reală, dar este clar că sunt necesare cercetări suplimentare asupra relației cauzale dintre nitriții acidificați și moartea microorganisme.

Snepar și colab. 25 au arătat că tratamentul cu cimetidină are un efect semnificativ în creșterea titrurilor microbiene gastrice. Numărul de organisme prezente în secrețiile gastrice se corelează direct cu pH-ul gastric. O creștere similară a fost observată de Verdu et al 26 în concentrația de bacterii reducătoare de nitrați după tratamentul cu omeprazol. Deși autorii nu au putut arăta o creștere concomitentă a concentrațiilor de nitriți gastrici, este posibil ca creșterea excesivă a acestor bacterii să aibă un rol în reducerea H pyloria după tratamentul inhibitor al acidului.

Alimentele care conțin o concentrație mare de nitrați sunt legume cu frunze verzi. Deoarece creșterea aportului alimentar de nitrați va avea ca rezultat creșterea nitriților salivați, ingestia de alimente bogate în nitrați poate proteja împotriva colonizării stomacului de către H pylori. Nu există dovezi epidemiologice că persoanele cu un aport ridicat de nitrați ar putea avea o prevalență redusă a organismului. Dimpotrivă, transmiterea infecției a fost legată de consumul de legume neprăjite27, iar infecția este dobândită mai devreme, cu un procent ridicat din populația adultă infectată în țările în curs de dezvoltare în care se așteaptă ca aportul de nitrați să fie relativ ridicat.1 Cu toate acestea, nu au fost efectuate investigații pentru a investiga relația dintre aportul de nitrați din dietă și supraviețuirea H pylori.

Indiferent dacă mecanismul antimicrobian al nitriților acidificați împotriva H pylori este activ sau nu, demonstrarea sa in vitro ar trebui să determine un studiu suplimentar al rolului oxizilor de azot în această infecție.