Biologia celulelor B

Editat de
Deborah K. Dunn-Walters

Universitatea din Surrey, Regatul Unit

Revizuite de
TAKASHI HASHIMOTO

Facultatea de Medicină, Universitatea din Osaka, Japonia

Mark L. Lang

University of Oklahoma Health Sciences Center, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

umani

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite
  • 2 Sylvester Comprehensive Cancer Center, Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite
  • 3 Miami Integrative Metabolomics Research Center (MIMRC), Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite
  • 4 Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Universitatea din Miami Școala de Medicină Miller, Miami, FL, Statele Unite

Introducere

Obezitatea este asociată cu producția redusă de anticorpi de protecție (1, 2) și creșterea producției de anticorpi autoimuni la șoareci (3) și oameni (4). Obezitatea și inflamația aferentă creează un mediu optim pentru dezvoltarea bolilor autoimune, deoarece duce la defalcarea mecanismelor de toleranță anti- „auto”, care, de asemenea, agravează progresia bolii. Rezultatele obținute la șoareci au arătat că șoarecii care au o dietă bogată în grăsimi, în comparație cu șoarecii care au o dietă cu grăsimi normale, au niveluri plasmatice mai ridicate de proteine ​​de șoc termic 60 (HSP60), care sunt asociate cu niveluri plasmatice mai ridicate de IgG2c specific Hsp60 (autoimune )) anticorpi (3). Rezultatele obținute la om au arătat că plasma indivizilor obezi cu rezistență la insulină (IR) conține autoanticorpi specifici proteinelor intracelulare, exprimate omniprezent în țesuturi, inclusiv pancreas, țesuturi nervoase, mușchi sau AT, precum și celule imune (4), sugerând eliberarea de antigeni „auto” în condiții de obezitate în țesuturile țintă ale insulinei. Majoritatea antigenelor „auto” sunt proteine ​​asociate celulelor (Golgi și proteine ​​ale reticulului endoplasmatic, ARN polimerază, glutation transferază, proteine ​​de semnalizare) cu expresie tisulară variabilă.

Din câte știm, nu există date publicate care să arate secreția de anticorpi cu specificități autoimune la AT obeză umană, după eliberarea locală a acestor antigeni „auto”. Am identificat recent mai multe mecanisme responsabile pentru eliberarea de „auto” antigeni în AT obeză umană, cum ar fi hipoxia, citotoxicitatea celulelor NK și deteriorarea ADN-ului, care induc moartea celulelor și eliberarea ulterioară a citokinelor pro-inflamatorii. Am arătat, de asemenea, că anticorpii IgG specifici adipocitelor sunt secretați în AT obezi umani și că celulele AT-B exprimă ARNm pentru citidina deaminază indusă de activare, enzima recombinării de comutare a clasei și hipermutația somatică, precum și pentru factorul de transcripție T -bet și markerul de membrană CD11c, ambii implicați în producerea de anticorpi IgG autoimuni (5). În prezenta lucrare, am caracterizat proteinele „auto” care au stimulat secreția anticorpilor autoimuni în culturile de celule imune derivate din AT. Mai mult decât atât, arătăm că adipocitele exprimă molecule de prezentare a antigenului CD1d și într-o măsură mai mică MHC clasa II și, prin urmare, sunt celule bune care prezintă antigen în AT obeză.

Materiale și metode

Subiecte

Experimentele au fost efectuate folosind AT obezat subcutanat aruncat de la femele supuse unei operații de reducere a sânilor la Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă de la Spitalul Universității din Miamin = 20, 25-55 ani), indicele de masă corporală (IMC, kg/m 2) 31-39.

Persoanele care au participat la studiu nu au avut boli și nu au folosit medicamente cunoscute pentru a modifica răspunsurile imune. Am exclus subiecții cu diabet zaharat de tip 2, insuficiență cardiacă congestivă, boli cardiovasculare, insuficiență renală cronică, tumori maligne, boli renale sau hepatice, boli autoimune, boli infecțioase, traume sau intervenții chirurgicale, sarcină sau abuz de substanțe actuale documentate și/sau abuz de alcool.

Participanții la studiu au oferit consimțământul informat în scris. Studiul a fost revizuit și aprobat de către biroul de cercetare al subiectului uman al Universității din Miami, cu consiliul de revizuire instituțională, protocoalele IRB # 20070481 și # 20160542, care analizează toate cercetările umane efectuate sub auspiciile Universității din Miami.

Șoarecii masculi C57BL/6 au fost cumpărați de la Institutul Național de Îmbătrânire și întreținuți în unitatea noastră certificată AAALAC. Șoarecii au fost aclimatizați timp de cel puțin 7 zile înainte de sacrificiu. Șoarecii cu dovezi de boală nu au fost folosiți în aceste studii. În experimentele de aici am folosit 4 șoareci obezi de vârstă mijlocie (12 luni). Toate studiile au aderat la principiile liniilor directoare de îngrijire a animalelor de laborator și au fost aprobate de IACUC (protocolul nr. 16-252).

Izolarea celulelor imune de la AT

AT epididimal de șoarece și AT uman subcutanat au fost recoltate de la șoareci obezi și pacienți obezi supuși intervențiilor chirurgicale de reducere a sânilor, respectiv cântărite și spălate cu soluție de sare echilibrată 1X Hanks (HBSS), așa cum am descris anterior (5, 6). Pe scurt, AT a fost spălat, tocat în bucăți mici, trecut printr-un filtru de 70 μm și digerat cu colagenază tip I (SIGMA C-9263) timp de 1 oră într-o baie de apă la 37 ° C. Celulele digerate au fost trecute printr-un filtru de 300 μm, centrifugat la 300 g pentru a separa adipocitele plutitoare de fracția vasculară stromală (SVF) care conține celulele imune. Adipocitele reprezintă fracțiunea „plutitoare” a AT după digestia colagenazei. Preparatele adipocitare nu sunt contaminate cu celule imune. SVF a fost apoi resuspendat în ACK pentru a liza celulele roșii din sânge, spălat, numărat și utilizat pentru citometrie în flux și in vitro experimente. SVF este un amestec de celule mezenchimale, endoteliale și imune. Fracția imună a SVF izolată din AT a șoarecilor obezi și a oamenilor conține macrofage M1, celule Th1, Th17, Tγδ, celule T CD8 + producătoare de IFN-γ, celule B și celule limfoide innate de tip 1, toate contribuind la secreția de citokine, chimiokine și adipokine pro-inflamatorii și la IR.

Culturi SVF

După izolare, celulele (2 × 106/ml) au fost resuspendate în mediu complet (c-RPMI, RPMI 1640, suplimentat cu 10% FCS, 10 μg/ml Pen-Strep, 1 mM Piruvat de sodiu și 2 × 10 -5 M 2-ME și 2 mM L-glutamină). Culturile au fost lăsate nestimulate timp de 10 zile, apoi supernatantele au fost colectate și măsurate prin ELISA pentru prezența IgG specifice adipocitelor.

Culturile au fost, de asemenea, înființate în absența macrofagelor (MΦ) care au fost îndepărtate prin aderență plastică. Pe scurt, celulele (2 × 106/ml) au fost resuspendate în 1X PBS, incubate timp de 3 ore la 37 ° C în cutii Petri (Falcon 3003), apoi ambele celule neaderente și MΦ au fost numărate cu un hemocitometru. Epuizarea MΦ a fost confirmată prin citometrie în flux.

SVF-ul epuizat cu MΦ a fost reconstituit cu MΦ sau cu adipocite. Raportul MΦ: celule imune (sau adipocite: celule imune) în SVF a fost egal cu ceea ce am măsurat în ex vivo SAT izolat. Culturile de MΦ și adipocite singure au fost utilizate ca martori negativi. Culturile au fost lăsate nestimulate timp de 10 zile, apoi supernatantele au fost colectate și secreția IgG specifică adipocitelor a fost evaluată prin ELISA.

În mod similar, adipocitele și SVF au fost obținute din tampoanele de grăsime epididimale ale șoarecilor obezi C57BL/6, așa cum s-a descris anterior (7). Înainte ca MΦ și adipocitele să fie adăugate înapoi la culturile SVF epuizate cu MΦ, acestea au fost tratate timp de 1 oră la 4 ° C cu următorii anticorpi: anti-MHC clasa II (IE kappa specific, 1: 100 diluat, Abcam ab25681) sau cu anti-CD1d (1: 100 diluat, Abcam ab119846).

Pregătirea extractelor de proteine ​​citoplasmatice

Pentru a măsura IgG specifice adipocitelor în plasmă și în supernatanții culturilor SVF, am pregătit extracte de proteine ​​citoplasmatice ale adipocitelor. Pe scurt, celulele au fost centrifugate într-o microfugă Eppendorf 5415C (2.000 rpm, 5 min). Peleta a fost resuspendată în 20 μl dintr-o soluție conținând Hepes 10 mM, pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 1,0 mM, DTT 1 mM, MgCl2 1,5 mM, PMSF 1 mM, 1 tabletă de cocktail inhibitor de protează (Boeringer Manheim) (pe 20 mL), Na3VO4 1 mM și Nonidet P-40 (0,1%), vortexat scurt și centrifugat (8.000 rpm, 5 min, 4 ° C). Supernatantul care conține extractul citoplasmatic a fost îndepărtat și depozitat la -80 ° C până la utilizare. Conținutul de proteine ​​a fost determinat de Bradford (8). Acesta este un test colorimetric de proteine ​​bazat pe legarea moleculelor de proteine ​​la colorantul Coomassie (ThermoFisher Scientific) care, în condiții acide, are ca rezultat o schimbare a culorii de la maro la albastru. Se utilizează ca referință albumina serică bovină (BSA) la concentrația de 2 mg/ml. Probele sunt citite într-un spectrofotometru setat la o lungime de undă de 595 nm.

ELISA

IgG specifice adipocitelor în plasmă și în supernatanții culturilor SVF au fost măsurate cu kituri ELISA cantitative de Ig uman (Bethyl Labs E80-104). Pe scurt, extracte citoplasmatice din adipocite la concentrația de 10 μg/ml în 1 × PBS au fost utilizate pentru acoperirea plăcilor ELISA. După 1 oră la temperatura camerei, plăcile au fost spălate, blocate cu 1 × PBS conținând 1% BSA (tampon de spălare) și apoi incubate timp de 30 min la 37 ° C. Apoi probele au fost adăugate și incubate la temperatura camerei timp de 3 ore. Godeurile au fost spălate temeinic cu tampon de spălare înainte de a primi anticorpul de detectare capră anti-IgG-Fc HRP conjugat (1: 5.000 diluat). După 1 oră de incubație la temperatura camerei, godeurile au fost spălate și li s-a dat soluția de substrat (cromogen TMB; Biosource SB01). Puțurile au fost incubate 15-20 min la temperatura camerei pentru a permite dezvoltarea reacțiilor. Conținutul godeului a fost măsurat pentru absorbanță la 405 nm.

Spectrometrie de masă (MS)

Am folosit SM pentru a identifica antigeni „auto” care au indus secreția anticorpilor IgG specifici în culturile SVF. Procedura experimentală a inclus următoarele etape: (1) îmbogățirea supernatantelor de cultură SVF în anticorpi IgG (2) digestia supernatantelor îmbogățite cu IgG cu tripsină și generarea unui amestec de peptide triptice (3) acidificarea peptidelor triptice pentru a le oferi un încărcare pozitivă (4) injectarea peptidelor încărcate într-o coloană de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), care permite separarea peptidelor și ieșirea către fragmentarea MS (5) a vârfurilor și urmărirea potrivirii computerizate a modelelor spectrale pentru a determina aminoacid secvențe și identifică proteinele prin corelarea spectrelor MS experimentale derivate din peptide cu spectrele teoretice prezise din bazele de date proteice.

Pentru a îmbogăți supernatanții culturii SVF în anticorpi IgG, am folosit un kit de imunoprecipitare (Dynabeads Protein G, ThermoFisher Scientific 100.07D), urmând instrucțiunile producătorului. Toate procedurile au fost efectuate la temperatura camerei. Pe scurt, proteina Dynabeads G a fost complet resuspendată prin agitare, apoi 50 ul au fost transferați într-un tub curat, plasat pe coloană și supernatantul separat pe magnet. Apoi tubul a fost îndepărtat din magnet, s-au adăugat anticorpi IgG (10 μg), amestecați ușor prin pipetare și incubați cu rotație 10 min. Tubul a fost plasat din nou pe magnet și supernatantul îndepărtat. Proba care conține antigenul (100 μl) a fost în cele din urmă adăugată și amestecată ușor prin pipetare. După 10 minute de incubație cu rotație, tubul a fost plasat pe magnet, complexele Dynabeads/antigen/anticorp au fost spălate temeinic și supernatantul îndepărtat după fiecare spălare. Eluția fără denaturare a antigenului țintă a avut loc în tub după adăugarea a 20 μl de tampon de eluție în rotație timp de 2 minute (necesar pentru disocierea complexului). Tubul a fost plasat pe magnet și supernatantul care conține materialul eluat a fost transferat într-un tub curat.

Imunofluorescența

Secțiunile de țesut proaspăt au fost obținute din AT obez subcutanat, au fost plasate în O.C.T. blocuri (Tissue-Tek 4583) și stocate la -80 ° C. Blocurile au fost secționate la 16 μm grosime și fixate în acetonă rece timp de 10 min. Pentru colorare, secțiunile de țesut au fost fixate în acetonă și spălate de două ori cu PBS. Secțiunile de țesut au fost apoi blocate timp de 1 oră cu 5% BSA la temperatura camerei și incubate cu anticorp anti-CD1d primar (abcam ab11076) sau cu anticorp primar anti-MHC clasa II (abcam ab55152), ambele diluate 1: 100, peste noapte la 4 ° C. A doua zi, lamele au fost spălate cu PBS de două ori timp de 5 minute și incubate cu următorii anticorpi secundari: AF488-capră conjugată IgG anti-șoarece (Biolegend 405319) pentru detectarea CD1d și AF647-capră conjugată anti-IgG șoarece (ThermoFisher InVitrogen A-21236) pentru detectarea MHC clasa II, ambele diluate 1: 100, 1 oră la temperatura camerei, sau cu martorii izotipului [IgG1 (Biolegend 401402) și IgG2a (Biolegend 401502), respectiv]. Lamele au fost apoi spălate de 3 ori, câte 3 min. Lamelele de acoperire au fost montate cu ProLong Gold Antifade Mountant și DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol, ThermoFisher Scientific), care colorează nucleele celulelor imune, pentru a vizualiza nucleele. Diapozitivele au fost realizate cu un microscop inversat Keyence.

Western Blotting (WB)

Pentru evaluarea proteinelor specifice, extractele de proteine ​​citoplasmatice din adipocite la concentrație egală de proteine ​​au fost denaturate și apoi electro-transferate pe membranele nitrocelulozice. Membranele au fost incubate cu următorii anticorpi primari în PBS-Tween 20 conținând 5% lapte: CD1d anti-uman de șoarece (1: 500 diluat, BioLegend 350302), MHC anti-uman de șoarece clasa II (1: 500 diluat, abcam ab55152), șoarece anti-uman UBC9 (1: 1.000 diluat, BD 617048). După incubarea peste noapte cu anticorpii primari, imunoblotii au fost incubați cu următorii anticorpi secundari timp de 3 ore la temperatura camerei: capră policlonală anti-șoarece IgG HRP conjugat (1: 50.000 diluat, Jackson ImmunoResearch Labs 115-035-003). Membranele au fost dezvoltate prin chemiluminescență enzimatică și expuse la CL-XPosure Film (Pierce). Filmele au fost scanate și analizate utilizând sistemul de documentare și analiză cu rezoluție îmbunătățită AlphaImager (Alpha Innotech), iar imaginile au fost cuantificate utilizând software-ul AlphaEaseFC pe 32 de biți.

Extracția ARN și PCR cantitativă (q)

După izolare, adipocitele au fost resuspendate în TRIzol (ThermoFisher Scientific) și sonicate, apoi ARN extras pentru PCR cantitativă (q). ARN-ul total a fost izolat conform protocolului producătorului, eluat în 10 μl de apă distilată și depozitat la -80 ° C până la utilizare. Reacțiile au fost efectuate pe plăci cu 96 de godeuri MicroAmp și rulate în mașina ABI 7300. Calculele au fost făcute cu software-ul ABI. Pe scurt, am determinat numărul ciclului la care transcrierile au atins un prag semnificativ (Ct) pentru fiecare genă țintă și pentru GAPDH ca control. O valoare a genei țintă, relativă la GAPDH, a fost calculată și exprimată ca ΔCt. Reactivii și primerii (Taqman) au fost de la ThermoFisher Scientific.

Anasise statistice

Comparațiile medii au fost efectuate printr-un mod ANOVA sau de către Student t-test (cu două cozi), utilizând software-ul GraphPad Prism versiunea 7, care a fost utilizat pentru a construi toate graficele.

Rezultate

Supernatanții culturilor SVF sunt îmbogățiți în anticorpi IgG specifici adipocitelor și sunt corelați cu nivelurile plasmatice de anticorpi IgG cu aceleași specificități

Am demonstrat anterior că supernatanții culturilor SVF sunt îmbogățiți în anticorpi IgG specifici adipocitelor (5). Acest lucru se întâmplă fără nici o stimulare exogenă, sugerând că procesul în curs de deces celular în AT duce la eliberarea de antigeni „auto” capabili să inducă activarea cronică a celulelor B fără a fi nevoie de stimulare suplimentară.

Aici confirmăm (Figura 1A) și extindem observația noastră inițială asupra unei cohorte diferite de indivizi, arătând că plasma acestor indivizi este, de asemenea, îmbogățită în anticorpi IgG cu specificități pentru antigenele derivate din adipocite. Aceste specificități sunt prezente doar în plasma persoanelor adulte obeze, dar nu slabe (9). Mai mult, IgG în culturile SVF și în plasmă de la indivizi obezi sunt semnificativ corelați (Figura 1B).

figura 1. Supernatanții culturilor SVF sunt îmbogățiți în anticorpi IgG specifici adipocitelor și sunt corelați cu nivelurile plasmatice de anticorpi IgG cu aceleași specificități. (A) Anticorpii IgG specifici adipocitelor au fost detectați de ELISA în supernatanții culturilor SVF și în plasma indivizilor obezi. (B) A lui Pearson r = 0,83, ****p Cuvinte cheie: țesut adipos, anticorpi autoimuni, adipocite, prezentarea antigenului, celule B

Citare: Frasca D, Diaz A, Romero M, Garcia D, Jayram D, Thaller S, del Carmen Piqueras M, Bhattacharya S și Blomberg BB (2020) Identificarea și caracterizarea anticorpilor umani derivați de țesut adipos cu specificitate „anti-sine”. Față. Immunol. 11: 392. doi: 10.3389/fimmu.2020.00392

Primit: 12 decembrie 2019; Acceptat: 19 februarie 2020;
Publicat: 28 februarie 2020.

Deborah K. Dunn-Walters, Universitatea din Surrey, Regatul Unit

Takashi Hashimoto, Universitatea din Osaka, Japonia
Mark L. Lang, Universitatea din Oklahoma Health Sciences Center, Statele Unite