1 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Universitatea din Beijing, Centrul de Științe pentru Sănătate; Laborator cheie de știință cardiovasculară moleculară, Ministerul Educației, Beijing 100191, China

polarizării

2 Departamentul de geriatrie, nr. 401 Spitalul PLA, Qingdao 266071, China

3 Departamentul de Patologie, Spitalul Central din Zibo, Zibo 255000, China

4 Departamentul Laboratorului Clinic, Spitalul Xuanwu, Universitatea Medicală Capitală, Beijing 100053, China

5 Departamentul de Chirurgie, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, MI, SUA

Abstract

1. Introducere

Ca ligand natural al receptorului secretagog al hormonului de creștere orfan de tip 1a (GHSR1a) [1, 2], grelina este o peptidă de 28 aminoacizi care este secretată de glandele oxintice gastrice și octanilată de ghrelină O-acil transferază (CAPRĂ), numai enzima care a fost identificată [3-5), care se exprimă predominant în stomac, intestin și pancreas și, de asemenea, în alte locuri [6]. ARNm de grelină umană codifică o peptidă de 117 aminoacizi, preprogrelin [7], care suferă prelucrări endoproteolitice și modificări posttranslaționale pentru a produce acilgrelin, des-acilgrelin și obestatin [8-12]. Nivelurile serice de acilgrelină cresc odată cu postul, sugerând că este un hormon orexigenic implicat în inițierea mesei [13, 14]. Acilgrelin reglează creșterea somatică, comportamentul de hrănire și homeostazia energetică la mamifere [15, 16] și stimulează, de asemenea, motilitatea stomacului și a intestinului subțire și secreția acidă la șobolani [4, 17]. În studiul nostru anterior, am constatat că eliminarea GHSR a îmbunătățit metabolismul glucozei în mușchii scheletici la șoareci [18].

Rezistența la insulină este baza comună în patogeneza bolilor legate de obezitate [19], cum ar fi sindromul metabolic, diabetul de tip 2 și ateroscleroza, care sunt aspecte de grad scăzut ale stărilor proinflamatorii. Cauzarea reciprocă a rezistenței la insulină, a obezității și a inflamației indică faptul că factorii inflamatori, chemokinele și imunocitele ar putea reduce sensibilitatea la insulină direct sau indirect, participând la apariția și dezvoltarea rezistenței la insulină.

Ca celule imune, macrofagele sunt pluripotente și joacă un rol important în imunitatea înnăscută. Polarizarea macrofagelor este considerată heterogenitate fenotipică a sistemului fagocitar mononuclear [20]. Ca urmare a diferențierii celulare, a distribuției pe scară largă a țesuturilor și a reacției la mulți stimuli endogeni și exogeni, macrofagele sunt împărțite în polarizare clasică sau M1 și alternativă sau M2. Macrofagele M1 sunt, de asemenea, denumite macrofage proinflamatorii, iar macrofagele M2 sunt denumite macrofage antiinflamatorii; primii factori proinflamatori secreți și au funcții proinflamatorii, iar cei mai târziu au funcții antiinflamatorii și sunt implicați în repararea țesuturilor [21].

În timpul obezității, infiltrarea macrofagelor în țesutul adipos este îmbunătățită și, în principal, fenotipul infiltrat este M1 [21]. Interacțiunea dintre macrofagele M1 și adipocite promovează secreția factorilor inflamatori, ceea ce duce la rezistența la insulină. Suprimarea inflamației sau inducerea transformării macrofagelor în țesutul adipos de la M1 la M2 poate ameliora rezistența la insulină și poate îmbunătăți sindromul metabolic asociat.

În studiul de față, am investigat polarizarea macrofagelor în țesutul adipos al șoarecilor knockout GHSR și am contribuit la un nou mecanism de sensibilitate la insulină îmbunătățit knockout GHSR.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

Acil ghrelin a fost achiziționat de la Phoenix Pharmaceuticals Inc. (Burlingame, CA). Anticorpii anti-fosfo-AKT de iepure (Ser473) și AKT provin de la Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anticorpul anti-LAMP-2 (Mac3/84) de șobolan și IgG conjugate cu izotiocianat de fluoresceină anti-iepure au fost de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). IgL anti-șobolan DyLigh 594-capră provine de la EarthOx LLC (EarthOx, CA).

2.2. Aprobare etică

Animalele utilizate în acest studiu au fost manipulate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de Institutul Național de Sănătate al SUA (publicația NIH nr. 85-23, revizuită în 1996) și toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din Universitatea Peking.

2.3. Animale și tratamente

Șoareci C57BL/6J, Ghsr1a șoareci knockout (GHSR -/-) au fost utilizați în studiul de față. Ghsr1a șoareci knockout genici la care exonul 1 și exonul 2 au fost șterse au fost obținuți de la Centrul de Cercetare Shanghai pentru Organisme Biomodel (Shanghai, China) [18, 22]. Ștergerea fișierului Ghsr1a fragmentul genei a fost confirmat de absența produselor genetice relative examinate prin RT-PCR. Șoarecii masculi în vârstă de 6 săptămâni au fost adăpostiți în microizolatori specifici fără patogeni și au fost menținuți într-un mediu reglementat (24 ° C, 12h ciclu lumină-întuneric, cu lumini aprinse la 07:00 AM). Chow și apă obișnuite erau disponibile ad libitum. Șoarecii au fost desemnați să primească chow de laborator standard (NCD) sau o dietă bogată în grăsimi (HFD) (45% grăsimi, D12451; Research Diets, New Brunswick, NJ, SUA) timp de 12 săptămâni.

2.4. Cultură de celule

Celulele RAW264.7, linia celulară murină peritoneală asemănătoare macrofagelor, au fost cultivate în mediu de creștere (mediu Eagle modificat Dulbecco cu conținut ridicat de glucoză (DMEM); Invitrogen, Grand Island, NY, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin inactivat termic (FBS; US Biotechnologies), 100 unități/ml penicilină și 100 unități/ml streptomicină (Invitrogen) și incubate la 37 ° C cu 5% CO2. Celulele au fost trecute săptămânal după detașarea tripsinei-EDTA. Toate studiile au fost efectuate pe celule RAW264.7 la pasajele 20-25. Apoi celulele au fost cultivate cu LPS (10 ng/ml) sau IL-4 (10 ng/ml) pentru a genera celule polarizate clasic (M1) sau alternativ (M2).

2.5. Test de toleranță la glucoză

Testul de toleranță la glucoză a fost efectuat așa cum este descris [18]. Sângele a fost extras dintr-o tăietură de la vârful cozii la 0, 30, 60, 90 și 120 min, iar concentrațiile de glucoză au fost detectate imediat cu Glucotrend de la Roche Diagnostics (Mannheim, Germania) conform instrucțiunilor producătorului.

2.6. Extracția ARN-ului și analiza PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost izolat folosind reactivul Trizol. Transcrierea inversă și PCR cantitativă în timp real au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [23-25]. PCR a fost efectuat într-un 25μl volum conținând 2,5 ng ADNc, 5mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,2μM fiecare exemplu, 1,25 U AmpliTaq Polymerase și 1μl 800x stoc SYBRGreen I diluat folosind sistemul PCR cantitativ multiplex Mx3000 (Stratagene, La Jolla, CA). Programul PCR a fost după cum urmează: menținerea 95 ° C timp de 7 minute; 95 ° C timp de 30 s, 60 ° C timp de 35 s și 72 ° C timp de 35 s. Expresia ARNm a fost cuantificată folosind metoda comparativă a pragului încrucișat (CT). Valoarea CT a genei menajere β-actina a fost scăzută din valoarea CT a genei țintă pentru a obține △ CT. Modificările normalizate ale ori ale expresiei ARNm ale genei detectate au fost exprimate ca 2-

CT = eșantion CT - control CT. Reacțiile PCR au fost efectuate în duplicat și fiecare experiment a fost repetat de 3-5 ori. Exemplele utilizate în acest studiu au fost prezentate în Tabelul 1.

2.7. Analiza Western Blot

După cum s-a descris anterior [23-25], țesutul adipos și celulele cultivate au fost rapid recoltate, clătite bine cu PBS și apoi omogenizate pe gheață în tampon de liză (50 mM Tris-Cl, 15 mM EGTA, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 suplimentat cu cocktail inhibitor de protează, pH 7,5). După centrifugare timp de 10 minute la 4 ° C, supernatantul a fost utilizat pentru analiza Western blot. Concentrația de proteine ​​a fost măsurată prin metoda lui Bradford. În total 60 μg proteină din fiecare probă a fost încărcată pe gel SDS-PAGE. Proteinele au fost transferate pe membranele de fluorură de poliviniliden. Membranele au fost incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu lapte fără grăsimi 5% în soluție salină tamponată Tris conținând Tween-20, urmată de incubare peste noapte la 4 ° C cu anticorpul primar individual. Reacția specifică a fost detectată utilizând al doilea anticorp conjugat cu IRDye și vizualizată utilizând sistemul de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Cuantificarea densității imaginii în pixeli a fost realizată utilizând sistemul de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

2.8. H&E Histology

Șoarecii au fost profund anesteziați folosind pentobarbital. Țesutul adipos epididimal a fost îndepărtat rapid și clătit bine cu PBS. Țesutul a fost fixat în paraformaldehidă 4%, deshidratat, încorporat în ceară și secționat la 6 μm. Diametrul fiecărui adipocit din fiecare câmp a fost măsurat folosind software-ul de analiză a imaginii Image J (v1.48). Pentru fiecare grup, dimensiunile celulelor de aproximativ 450 de adipocite de la 3-4 șoareci au fost măsurate și reprezentate grafic ca histograme.

2.9. Imunofluorescența

Șoarecii au fost profund anesteziați folosind pentobarbital. Aceeași parte a țesutului adipos a fost îndepărtată rapid și clătită bine cu PBS. Țesutul a fost fixat în paraformaldehidă 4%, deshidratat, încorporat în ceară și secționat la 6μm. Secțiunile încorporate în parafină au fost depilate, rehidratate și clătite în PBS. După fierbere timp de 10 min în tampon citrat de sodiu 10 mM (pH 6,0), secțiunile au fost blocate în 1% BSA în PBS timp de 1 oră la temperatura camerei, apoi incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpul LAMP-2 (Mac3/84) singur, și apoi spălat în 1X PBS/0,1% Tween-20 de trei ori timp de 5 minute fiecare. Secțiunile de țesut au fost apoi incubate la temperatura camerei timp de 1 oră cu următorii anticorpi secundari (IgL anti-șobolan DyLigh 594-capră). Controalele au inclus înlocuirea anticorpului primar cu IgG de șobolan. Nucleii au fost vizualizați prin colorare cu Hoechst 33258 timp de 10 minute. Fotomicrografiile au fost realizate la microscop confocal cu scanare laser (Leica, Germania).

2.10. Analize statistice

Datele au fost exprimate ca medii ± SEM. Analiza datelor a folosit software-ul GraphPad Prism. ANOVA unidirecțional, testul Student-Newman-Keul (comparații între mai multe grupuri) sau testul studentului nepereche t-testul (între două grupuri) a fost utilizat după caz. Valoarea P
(A)
(b)
(c)
(d)
(e)

denotă P # denotă P
(A)
(b)
(c)

Conferința Asociației Chineze pentru Științe Fiziologice.

Conflicte de interes

Autorii declară că nu au conflicte de interese.

Contribuțiile autorilor

Fang Yuan și Jian Ma au contribuit în mod egal la această lucrare.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (81670780 către Yin Li și 81600695 către Xinxin Xiang).

Materiale suplimentare

Au fost prezentate figura suplimentară online și legenda. (Materiale suplimentare)

Referințe