Hui-Hua Chang

1 Departamentul de Chirurgie, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

cancerului

Aune Moro

1 Departamentul de Chirurgie, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Kazuki Takakura

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Hsin-Yuan Su

4 Grup de cercetare pancreatică, Departamentul de Medicină, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Allen Mo

5 Center for Molecular Oncology, UCONN Health, Farmington, CT, Statele Unite ale Americii

Masako Nakanishi

5 Center for Molecular Oncology, UCONN Health, Farmington, CT, Statele Unite ale Americii

Richard T. Waldron

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

4 Grup de cercetare pancreatică, Departamentul de Medicină, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Samuel W. francez

6 Departamentul de patologie, Harbor-UCLA Medical Center, Torrance, CA, Statele Unite ale Americii

7 Centrul de cercetare pentru sudul Californiei pentru ALPD și ciroză, Departamentul de patologie, Școala de medicină Keck a Universității din California de Sud, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

David W. Dawson

8 Departamentul de patologie și medicină de laborator, Școala de medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

O. Joe Hines

1 Departamentul de Chirurgie, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Gang Li

9 Departamentul de Biostatistică, Școala de Sănătate Publică de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Vay Liang W. Du-te

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

James Sinnett-Smith

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Stephen J. Pandol

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

4 Grup de cercetare pancreatică, Departamentul de Medicină, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Aurelia Lugea

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

4 Grup de cercetare pancreatică, Departamentul de Medicină, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Anna S. Gukovskaya

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Michael O. Duff

10 Departamentul de Genetică și Științe ale Genomului, UCONN Health, Farmington, CT, Statele Unite ale Americii

Daniel W. Rosenberg

5 Center for Molecular Oncology, UCONN Health, Farmington, CT, Statele Unite ale Americii

Enrique Rozengurt

2 Divizia de Boli Digestive, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

3 Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Guido Eibl

1 Departamentul de Chirurgie, Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, Los Angeles, CA, Statele Unite ale Americii

Date asociate

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Abstract

Introducere

Cancerul pancreatic, dintre care adenocarcinomul ductal pancreatic (PDAC) reprezintă marea majoritate, este o boală remarcabil de agresivă și letală, cu o rată de supraviețuire globală de 5 ani de doar aproximativ 8% [1]. Incidența acestei boli în SUA se estimează că va crește la 53.670 de cazuri noi în 2017 și este în prezent a patra cauză principală de mortalitate prin cancer atât la bărbați, cât și la femei [1]. În ciuda progreselor în înțelegerea biologiei tumorale a dezvoltării cancerului pancreatic, terapia orientată molecular nu a fost transpusă în prognostic îmbunătățit substanțial al acestei boli mortale. Într-adevăr, se preconizează că totalul deceselor cauzate de cancerul pancreatic va crește dramatic pentru a deveni a doua cauză principală de decese cauzate de cancer înainte de 2030 [2]. În consecință, accentul cercetării s-a deplasat treptat spre prevenirea și interceptarea sa [3-5]. Sunt necesare urgent obiective și agenți noi pentru prevenirea chimioterapiei și/sau a dietei și vor proveni cel mai probabil din identificarea factorilor de risc modificabili și dintr-o înțelegere mai detaliată a mecanismelor moleculare care stimulează promovarea și progresia PDAC.

Pentru a oferi o platformă pentru studii mecaniciste detaliate, am descris anterior un model foarte relevant de neoplazie pancreatică promovată de dietă. Mai exact, o dietă bogată în grăsimi și bogată în calorii (HFCD) a fost administrată timp de 3 luni la șoareci P48 +/Cre; șoareci LSL-KRAS G12D (KC) care au o mutație Kras oncogenă specifică pancreasului [20]. În comparație cu animalele hrănite cu o dietă de control (CD), șoarecii din grupul HFCD au câștigat în mod semnificativ mai multă greutate și au dezvoltat hiperinsulinemie, hiperglicemie și hiperleptinemie care recapitulează condițiile asociate cu sindromul metabolic uman. Important, pancreasul șoarecilor KC hrăniți cu HFCD a prezentat inflamație îmbunătățită, fibroză stromală crescută și leziuni PanIN mai avansate [20]. Mai mult, șoarecii de pe HFCD au prezentat o reacție inflamatorie semnificativ crescută în țesutul adipos visceral (TVA), în special în grăsimea peri-pancreatică (PPF), comparativ cu animalele de pe un CD [21]. Aceste rezultate sugerează că inflamația asociată cu obezitatea în pancreas și TVA înconjurător poate accelera neoplazia pancreatică precoce la șoarecii KC. Cu toate acestea, efectele HFCD asupra dezvoltării cancerului pancreatic invaziv nu au fost explorate. De asemenea, dinamica tumorigenezei promovate de HFCD nu a fost abordată în studiile anterioare cu analiză pe termen scurt și punct de timp unic.

Aici, prezentăm alte analize longitudinale și detaliate ale dezvoltării tumorii pancreatice invazive la șoareci KC. Au fost investigate efectele HFCD asupra căilor inflamatorii, fibrotice și autofagice. În plus, am efectuat secvențierea exomei pe leziuni PanIN avansate izolate pentru a investiga modificările genetice asociate HFCD. Datele noastre arată clar că obezitatea indusă de dietă poate promova dezvoltarea cancerului pancreatic invaziv la șoareci KC de sex feminin și masculin, oferind un model adecvat și valoros pentru a investiga în continuare semnalele moleculare de bază și pentru a evalua intervențiile care vizează dezvoltarea cancerului pancreatic asociat cu obezitatea. Mai mult, am descris pentru prima dată variante genetice în leziunile PanIN avansate, care sunt unice pentru obezitatea HFCD și indusă de HFCD, sugerând că modificările genetice induse de dietă pot sta la baza și/sau contribui la accelerarea dezvoltării PDAC de către HFCD.

Materiale și metode

Animale experimentale

Modelul condiționat KrasG12D (KC) al neoplaziei pancreatice [22] a fost utilizat pentru acest studiu. După înțărcare, descendenții încrucișați de șoareci LSL-KRAS G12D și P48 +/Cre au fost alocați aleatoriu fie unei diete de control (CD), fie unei diete bogate în grăsimi și bogate în calorii (HFCD). Șoarecii etichetați individual aveau acces gratuit la dietă, precum și la apă. Greutatea corporală, sănătatea și comportamentul animalelor au fost monitorizate săptămânal. Diferite cohorte de șoareci masculi și femele au fost sacrificate la vârsta de 3, 6 și 9 luni, iar țesuturile au fost recoltate pentru analiză histologică. Studiile pe animale au fost aprobate de către Comitetul de cercetare a animalelor al cancelarului de la Universitatea din California, Los Angeles, în conformitate cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (număr de protocol: 2011-118-11). Animalele au fost eutanasiate prematur dacă au apărut semne de dezvoltare tumorală avansată (ascită, masă palpabilă, icter, cașexie, scădere în greutate mai mare de 10%). Niciunul dintre animale nu a murit fără eutanasie.

Analiza genotipării

Înainte de randomizarea dietelor de studiu, prezența alelelor LSL-KRAS G12D și Cre la animale au fost determinate prin analiza PCR a ADN-ului genomic, așa cum este descris în altă parte [23]. Animalele cu ambele alele LSL-KRAS G12D și Cre au fost desemnate ca mutante (KC), iar animalele fără nici o alelă au fost considerate de tip sălbatic (WT).

Dietele experimentale

Dietele au fost obținute de la Dyets, Inc. (Betleem, PA). Șoarecii la vârsta de 1 lună au fost alocați aleatoriu pentru a primi CD sau HFCD. Compoziția detaliată a dietelor este prezentată în S1 Tabel. Pe scurt, 12% și 40% din calorii au fost derivate din grăsimi (pe bază de ulei de porumb) din CD și, respectiv, HFCD. Dietele au fost manipulate în condiții de lumină slabă și depozitate la -20 ° C pentru depozitare pe termen lung sau la 4 ° C pentru depozitare pe termen scurt în recipiente sigilate. Dietele date șoarecilor au fost înlocuite săptămânal.

Panou metabolic

După ce sângele a fost colectat de la șoareci prin puncție cardiacă, plasma a fost separată prin centrifugare la 5.000 rpm timp de 10 minute la temperatura camerei și apoi stocată la -80 ° C până la utilizare. Nivelurile plasmatice de insulină și leptină au fost măsurate folosind panoul de margele magnetică Adipokine MILLIPLEX MAP Mouse - Endocrine Multiplex Assay (EMD Millipore, Billerica, MA) conform instrucțiunilor producătorului. Chimia sângelui (colesterol, glucoză și trigliceride) a fost obținută de Divizia UCLA de Medicină Animală de Laborator.

Histologia pancreasului

Țesuturile pancreatice fixate pe formalină, încorporate în parafină (FFPE) ale fiecărui animal au fost secționate (4 μm) și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și au fost analizate histologic de către un patolog gastrointestinal orbit de grupurile experimentale. Inflamația a fost gradată așa cum s-a descris anterior [20]. Pierderea acinară sa bazat pe pierderea procentuală pe întreaga secțiune transversală și a fost clasificată ca 0 = absentă; 1 = 1-25%; 2 = 26-50%; 3 = 51-75%; și 4> 75%. Inflamația s-a bazat pe numărul mediu de celule inflamatorii lobulare pe 40x câmp de putere mare (HPF; așa cum s-a numărat în 10 HPF care nu se suprapun) și clasificată ca 0 = absentă; 1 = 1-30 celule; 2 = 31-50 celule; 3 = 51-100 celule; și 4> 100 celule. Fibroza sa bazat pe aria cumulativă a fibrozei stromale pe întregul pancreas și a fost clasificată ca 0 = absentă; 1 = 1-5%; 2 = 6-10%; 3 = 11-20%; și 4> 20%. PanIN-urile murine și adenocarcinoamele ductale invazive au fost clasificate în funcție de criteriile histopatologice descrise anterior [24, 25]. S-a determinat numărul total de leziuni ductale și gradul lor. A fost evaluată doar leziunea de cel mai înalt grad pe lobul pancreatic. Aproximativ 100 de canale pancreatice din întregul specimen fix (coada pancreasului) au fost analizate pentru fiecare animal. Proporția relativă a fiecărui mPanIN cu numărul total de conducte analizate a fost înregistrată pentru fiecare animal.

Sirius colorare roșie

Secțiunile (4 μm) din țesuturile FFPE au fost colorate cu roșu Sirius (care colorează colagenul roșu) pentru a evalua gradul de depunere a colagenului. Diapozitivele colorate întregi au fost scanate folosind scanerul de diapozitive AT Turbo (Aperio, Vista, CA) și imaginile digitalizate au fost vizualizate folosind Hubul de imagine digital Leica (microsistemele Leica). Suprafața totală de fibroză colorată de roșu Sirius în fiecare specimen a fost cuantificată prin analiză morfometrică în cel puțin 10 secțiuni digitalizate, care nu se suprapun la mărirea X200 utilizând sistemul de imagistică MetaMorph (Universal Imaging Corporation, PA) și exprimată ca procent din suprafața totală a țesutului . Procentul de suprafață colorată cu roșu Sirius în fiecare specimen a fost calculat ca o medie a datelor obținute din toate secțiunile digitalizate; au fost măsurate cel puțin două specimene pe șoarece și s-au investigat 3-4 șoareci pe grup.

Western blot

Probele de țesut pancreatic de șoarece au fost omogenizate în tampon RIPA (test de radio-imunoprecipitare) conținând 50 mmol/L Tris (pH 7,4), 150 mmol/L NaCl, 1% acid deoxicolic, 1% Triton X-100, 0,1% SDS și un amestec a inhibitorilor de protează și fosfatază (Roche Applied Science, Basel, Elveția). Extractele de proteine ​​au fost rezolvate prin SDS-PAGE pentru analiza imunoblotului. Au fost utilizați următorii anticorpi primari: fibronectina (# F3648), prolil-4-hidroxilaza (P4HA; # 2SAB1100773), α-SMA (# A2547) și amilaza (# A8273) au fost cumpărate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) )); cadherin 11 (# 4442), p-STAT3 (Tyr 705; # 9145) și STAT3 total (# 9132) de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA) și gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH; # 9484) de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie). Anticorpii secundari specifici conjugați cu peroxidază de hrean au fost de la tehnologia de semnalizare celulară (iepure și șoarece). Anticorpii au fost diluați în conformitate cu recomandarea producătorului. Benzile imuno-reactive au fost vizualizate prin chemiluminescență (Pierce) și cuantificate densitometric folosind sistemul PXi Touch Imaging System (Syngene). Pentru a estima nivelurile de proteine, valorile densității optice în fiecare blot au fost exprimate relativ la cele ale controlului de încărcare corespunzător.

Colorarea imunofluorescentă

Colorarea prin imunofluorescență (IF) pentru LC3 și p62 a fost efectuată pe secțiuni de țesut pancreas FFPE. După deparafinarea xilenului, deshidratarea etanolului și recuperarea antigenului indus de căldură cu 0,01 M citrat pH 6,0, s-a blocat legarea nespecifică cu 5% iepure sau 5% ser de capră. Secțiunile de țesut au fost incubate cu anticorpi primari, urmate de incubare cu anticorpi secundari conjugați FITC sau Texas Red. Anticorpul primar împotriva LC3-B a fost achiziționat de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA), iar anticorpul împotriva p62/SQSTM1 a fost de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie). Imaginile IF au fost achiziționate cu un microscop confocal Zeiss LSM 710 folosind un obiectiv 63x. Nucleii au fost colorați cu DAPI. Contrastul de interferență diferențială (DIC) a fost utilizat pentru a afișa histologia pancreasului.

Secvențierea Exome

Țesuturile de pancreas recoltate au fost încorporate în TTPM. Secțiunile seriale au fost pregătite pe diapozitive PEN pentru microdisecție cu captare laser (LCM). Leziunile PanIN-2/3 (identificate din diapozitive flancante H&E) au fost capturate cu laser cu secțiuni seriale pe Capsure LCM Caps folosind un instrument ArcturusXT LCM. Capacele au fost extrase folosind kitul de extracție ADN PicoPure de la Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). ADN-ul extras a fost amplificat folosind kitul de amplificare ADN SeqPlex (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și testat pentru calitate folosind un Bioanalyzer 2100 și rulat pe un gel de 1% înainte de prepararea bibliotecii. Bibliotecile de probe au fost pregătite folosind Kit-ul Swift Biosciences (Accel NGS 2 plus) și kitul de post-captare Agilent Sure Select XT Mouse Exome, urmând instrucțiunile producătorului. Bibliotecile de eșantioane au fost reunite și au rulat pereche (2x75 bp) pe un Illumina NextSeq 500 pentru o medie de 90 de milioane de citiri pe eșantion.

Analiza datelor secvențiale

Apelare variantă, adnotare și prioritizare

Analiza căii

Analizele căilor au fost efectuate utilizând baza de date disponibilă public, ConsensusPathDB (CPDB, http://cpdb.molgen.mpg.de/MCPDB). CPDB încorporează date din 16 baze de date publice pentru a genera rețele de interacțiune potențial asociate cu lista de gene specificată de utilizator. Genele cu cel puțin o variantă unică pentru HFCD au fost analizate printr-o analiză a căii supra-reprezentate. Am selectat căi care corespundeau cel puțin 10 gene din listă cu pragul implicit al valorii p de 0,01. O valoare p în acest software este determinată ca rezultat al testului hipergeometric bazat pe numărul de entități fizice prezente atât în ​​setul predefinit, cât și în lista de entități fizice specificate de utilizator.

analize statistice

Valorile sunt prezentate ca media ± SD sau SEM. Pentru a determina semnificația statistică, au fost efectuate teste ANOVA unidirecționale (sau bidirecționale) și t-Student cu două cozi presupunând variații inegale. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă și a fost indicată cu un asterisc (*).