• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: awoods @ calibr.orgschultz @ scripps.eduwshen @ calibr.org

  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: awoods @ calibr.orgschultz @ scripps.eduwshen @ calibr.org

Contribuit de Peter G. Schultz, 18 februarie 2016 (trimis spre examinare 24 decembrie 2015; revizuit de William F. DeGrado și Marc Montminy)

glp-1

Semnificaţie

Multe peptide terapeutice suferă de timp de înjumătățire plasmatică scurt și, în consecință, necesită injecții frecvente pentru a fi eficiente terapeutic; la rândul său, acest lucru poate afecta negativ complianța pacientului. Aici, descriem dezvoltarea unei noi strategii de inginerie a peptidelor care încorporează un motiv de legare a proteinelor serice într-o bază covalentă a lanțului lateral. Această abordare a fost utilizată pentru a genera analogi de peptidă-1 asemănători glucagonului cu acțiune îndelungată, cu potență comparabilă cu exendina-4 și proprietăți farmacocinetice îmbunătățite semnificativ. Administrarea printr-un sistem transdermic bazat pe microstructură dizolvabilă a dus la concentrații terapeutice susținute în sânge cu activitate de scădere a glucozei la cobai. Această abordare oferă probabil o platformă generală și simplă pentru generarea de hormoni peptidici cu acțiune lungă capsată pentru o serie de aplicații terapeutice.

Abstract

Receptorii cuplați cu proteina G din familia B (GPCR) includ receptori pentru hormoni peptidici cum ar fi glucagon, peptidele asemănătoare glucagonului 1 și 2 (GLP-1 și -2), hormonul paratiroidian (PTH) și factorul de eliberare a corticotropinei. Încercările de a genera modulatori cu molecule mici ale acestor receptori au avut un succes limitat, în timp ce liganzii peptidici s-au dovedit a fi agenți terapeutici eficienți, după cum se exemplifică prin exenatidă (alias exendin-4 sau Ex-4) și agonistul receptorului GLP-1 pentru diabet, și teriparatidă, un agonist al receptorilor PTH1 pentru osteoporoză (1). Cu toate acestea, medicamentele pe bază de peptide suferă în general de perioade de înjumătățire scurtă din cauza degradării proteolitice și a clearance-ului renal rapid, ceea ce face necesare doze mai mari și injecții frecvente, ceea ce afectează negativ complianța pacientului (2). Pentru a-și îmbunătăți proprietățile farmacologice, peptidele au fost modificate chimic prin restricție conformațională (3 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –13) pentru a crește potența și a reduce proteoliza, precum și prin lipidare (14 ⇓ –16), conjugarea polimerului F ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –23), și fuziunea proteinelor (24 ⇓ –26) pentru scăderea clearance-ului renal. Deși acești ultimi conjugați pot avea perioade de înjumătățire circulatorie îmbunătățite, adesea suferă de o potență redusă și, ca urmare, necesită injectarea unor cantități relativ mari de peptide modificate.

Agoniștii receptorilor GLP-1 (GLP-1RAs) reprezintă o abordare unică a tratamentului diabetului, cu beneficii dincolo de controlul glucozei, inclusiv efecte benefice asupra greutății corporale, tensiunii arteriale, nivelului de colesterol și funcției celulelor beta (27). În prezent, în Statele Unite sunt aprobate două GLP-1RA cu acțiune scurtă (exenatidă și liraglutidă; administrare o dată sau de două ori pe zi) și trei cu acțiune lungă (albiglutidă, dulaglutidă și exenatidă LAR; administrare săptămânală). Aceste medicamente imită efectele hormonului incretinic GLP-1 care apar în mod natural prin activarea receptorilor GLP-1 în pancreas, ceea ce duce la eliberarea îmbunătățită a insulinei și eliberarea redusă a glucagonului într-o manieră dependentă de glucoză - cu un risc în consecință scăzut de hipoglicemie. Efectele acestor GLP-1RAs asupra receptorilor GLP-1 din SNC și tractul gastro-intestinal conduc, de asemenea, la apetitul redus și absorbția întârziată a glucozei, cu scăderea în greutate concomitentă (28).

Având în vedere biodisponibilitatea lor orală limitată, aceste GLP-1RA sunt date în prezent sub formă de s.c. injecţie. Livrarea transdermică este o alternativă atractivă, deoarece este relativ neinvazivă și nedureroasă și evită efectul de primă trecere (29). Microstructurile, cunoscute și sub numele de microacele, sunt structuri la scară micrometrică care pătrund în stratul de barieră al stratului cornos al pielii, creând conducte temporare pentru medicamente care nu pot pătrunde pasiv în piele datorită dimensiunii lor moleculare mari și a naturii hidrofile (30, 31). Această tehnologie necesită molecule extrem de puternice, dar oferă o serie de avantaje, inclusiv administrarea fără durere și simplificată, și a fost evaluată cu succes pentru livrarea transdermică a unui număr de molecule mari, inclusiv vaccinuri și analogi PTH umani atât în ​​condiții preclinice cât și clinice (32, 33). Aici descriem aplicarea unui discontinus al catenei laterale de cisteină derivat din acizi grași la generarea unui analog Ex-4 puternic, cu acțiune îndelungată, care prezintă farmacocinetică și farmacodinamică excelente atunci când este administrat la cobai prin microstructuri dizolvabile.

Rezultate si discutii

Cross-Linker și design peptidic.

Proiectarea, activitatea in vitro și alfa-helicitatea analogilor Ex-4 reticulați. (A) Secvențe de Ex-4 și mutanții săi dubli cisteină distanțați la i, i + 7; i, i + 11 și i, i + 14. (B) Model structural al Ex-4 (9-39) legat de domeniul amino-terminal al receptorului GLP-1 (codul PDB ID 3C59), cu site-urile de reticulare colorate în galben. (C) Structuri de legături încrucișate care conțin fracțiune bromoacetamidă: L1-L10 pe bază de alchil, L11-L12 pe bază de PEG și linkeri L-L15-L15 pe bază de acid gras PEG derivat din ornitină. (E) Activitatea in vitro a peptidelor reprezentative reticulate în testul reporter CRE-Luc mediat de GLP-1R. (F) Analiza CD a peptidelor reticulate. Datele reprezintă media ± SEM pentru experimentele efectuate în triplicat.

Sinteza cAMP mediată de receptor și spectrele CD.

Apoi am determinat alfa-helicitatea celor mai puternice peptide capsate și lipidice conjugate prin CD folosind Ex-4 ca control pozitiv. La temperatura camerei, spectrele CD ale E1, E5 și E6 (i, i + 7 reticulat) și E2 (i, i + 11 reticulat) au prezentat o creștere semnificativă a alfa-helicității în comparație cu descompunerea corespunzătoare peptidele legate SEQ-1 și SEQ-2 (Fig. 1F). În special, SEQ-1 nu formează o structură alfa-elicoidală în apă. Aceste rezultate sugerează că activarea crescută a receptorilor rezultă din stabilizarea segmentelor elicoidale de către punțile tioeter. Interesant este faptul că linkerul C15 bazat pe diacid L15 a arătat cea mai mare creștere a alfa-helicității, urmată de L14 și în cele din urmă L2, susținând rapoartele anterioare că lipidarea poate stabiliza și structura elicoidală și poate modifica funcția biologică (40).

Test de farmacocinetică și toleranță orală la glucoză la șoareci WT.

Tratamentul de cinci săptămâni al șoarecilor DIO cu E6 (7,5 nmol/kg s.c.). (A - L) Efecte asupra modificării greutății corporale (A), glicemiei postite în zilele 14 și 36 (B), aportul cumulativ de alimente (C), OGTT în ziua 14 (D), IPGTT în ziua 36 (E), maro grăsime (F) și schimbare de masă viscerală (G), niveluri de mARN de PPAR-gamma în grăsimi brune (H), colesterol plasmatic (I), trigliceride plasmatice (J), trigliceride hepatice (K) la șoareci DIO masculi în ziua 36 ( vârsta de 8 luni; n = 9 per grup), și efect (L) asupra steatozei hepatice a șoarecilor DIO. Săgețile indică timpul postului pentru testul de toleranță la glucoză. * P 2 în zonă) care poartă,85.800 microstructuri dizolvabile, așa cum se arată în Fig. 4A și așa cum s-a descris anterior (33). Încărcarea medie a E6 a fost de 57 μg pe 2 cm 2 matrice. MSA rezultat a constat dintr-un strat dizolvabil de droguri în vârf (DIT) și un strat de suport polimer (acid lactic-co-glicolic) (PLGA) nedizolvabil (PLGA) pe bază de polimer care conectează și susține vârfurile MSA din plasture. Inspecția microscopică a MSA-urilor a relevat microstructuri ascuțite, bine formate (Fig. 4B).

Fabricarea și caracterizarea MSA-urilor care conțin E6. (A) Schema de fabricație MicroCor: MSA-urile au fost fabricate prin turnarea formulării DIT care conține E6 și excipienți într-o matriță PDMS și uscare pentru a forma vârfurile de microstructură dizolvabile. Un strat de suport PLGA a fost apoi turnat și uscat peste stratul DIT, după care MSA a fost îndepărtat din matriță. (B) Imagine SEM care arată microstructurile ascuțite ale unui E6 MSA fabricat. (Bara de scară, 500 μm.) (C) Fotografie reprezentativă a pielii porcine excizate după o aplicare de 5 minute a unui MSA E6 de 2 cm 2 in vitro și apoi colorare pentru a evidenția penetrările individuale (vedere mărită).

Pentru a evalua rezistența mecanică a microstructurilor, MSA E6 au fost aplicate in vitro pe pielea porcină excizată și locurile de aplicare au fost apoi colorate cu un colorant pentru a vizualiza penetrările. Microstructurile au pătruns cu succes în piele, rezultând modele uniforme de penetrare, demonstrând robustețea mecanică a microstructurilor care conțin E6 (Fig. 4C). Mai mult, inspecțiile MSA după aplicarea pielii au confirmat că vârfurile microstructurii care conțin peptide au pătruns și s-au dizolvat în piele, lăsând în urmă buturugile stratului de suport PLGA nedisolvabil (anexa SI, fig. S5).

Deoarece stabilitatea la temperatura camerei este un atribut cheie al produsului atât pentru permiterea autoadministrării plasturilor de microstructură, cât și pentru eliminarea necesității de gestionare a lanțului de frig în timpul distribuției, am examinat apoi stabilitatea la depozitare a MSA-urilor E6 prin cromatografie lichidă ultra-performantă în fază inversă (UPLC ). Datele preliminare au demonstrat că nu au fost observate vârfuri suplimentare pentru peptida MSA fabricată după ce a fost depozitată la 25 ° C timp de 2 săptămâni sau la 5 ° C timp de 6 săptămâni (timpul maxim testat; Anexa SI, Fig. S6), indicând faptul că peptida E6 a fost stabil în MSA.

Evaluarea PK și PD a MSA-urilor E6 la cobai.

Aplicarea in vivo a MSA-urilor în cobai pentru studii PK și PD.

Porcii de guineea Dunkin-Hartley masculi cu o greutate de ~ 400 g au fost obținuți de la Charles River Laboratories și utilizați pentru testarea PK și PD a MS6 E6. Pentru a pregăti animalele pentru aplicații MSA, părul de pe spatele și părțile laterale ale fiecărui animal a fost îndepărtat prin tăiere și bărbierit atent. Tablourile au fost apoi aplicate pe o clapă de piele dorsală folosind același aplicator pe bază de arc descris anterior (33). La cinci minute după aplicare, MSA a fost îndepărtat de pe piele și păstrat pentru analiza peptidelor reziduale. La cincisprezece minute după îndepărtarea MSA, pielea a fost ușor tamponată pentru a colecta orice peptidă reziduală rămasă pe piele. MSA-urile și tampoanele de piele utilizate au fost testate pentru peptida E6 reziduală prin UPLC în fază inversă; pe baza acestor rezultate și a încărcăturii inițiale de medicament, s-a determinat doza aparentă administrată pentru E6 MSA.

Pentru studiul PC la cobai, animalele au fost dozate cu E6 de i.v. injecție, s.c. injecție sau o aplicare de 5 minute a unui E6 MSA pe piele (n = 4 per grup). Pentru fiecare grup, peptida a fost administrată la un nivel al dozei țintă de 22,5 nmol/kg. Sângele a fost extras în diferite momente de timp (5 și 30 min și 1, 2, 3, 5, 8, 24, 32, 48 și 72 h postdozare) și concentrația peptidei în plasmă a fost determinată prin testul de activitate GLP-1R in vitro așa cum este descris în anexa SI. Biodisponibilitatea relativă a fost calculată ca raportul ASC normalizat în doză între aplicarea MSA și s.c. grupuri de injectare.

Pentru studiul PD la cobai, animalele (n = 4 per grup) au fost postite timp de 4 ore și tratate cu un plasture MSA (un placebo MSA ca control negativ) pe piele timp de 5 minute. După 24, 48 și 96 de ore, animalele au fost administrate oral cu 2 g de soluție de glucoză per kg de greutate corporală, iar nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate înainte (0 min) și după provocarea glucozei pentru momentul indicat.

Note de subsol

↵ 1 P.-Y.Y. și H.Z. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Contribuțiile autorului: P.-Y.Y., H.Z., G.C., P.S., A.K.W., P.G.S. și W.S. cercetare proiectată; P.-Y.Y., H.Z., E.C., L.S., V.N., M.K., E.G.-T., Z.D., H.Q., X.L., G.W. și A.K.W. cercetări efectuate; P.-Y.Y., H.Z., G.W., G.C., A.K.W. și W.S. date analizate; și P.-Y.Y., P.G.S. și W.S. a scris ziarul.

Recenzori: W.F.D., Școala de Farmacie, Universitatea din California, San Francisco; și MM, Institutul Salk pentru Studii Biologice.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Disponibil gratuit online prin opțiunea de acces deschis PNAS.