Inhibitorul Mdm2 Nutlin-3a induce apoptoza mediată de p53 prin mecanisme dependente de transcripție și independente de transcripție și poate depăși rezistența mediată de ATM la fludarabină în leucemia limfocitară cronică

Kensuke Kojima, Marina Konopleva, Teresa McQueen, Susan O'Brien, William Plunkett, Michael Andreeff; Inhibitorul Mdm2 Nutlin-3a induce apoptoza mediată de p53 prin mecanisme dependente de transcripție și independente de transcripție și poate depăși rezistența mediată de ATM la fludarabină în leucemia limfocitară cronică. Blood 2006; 108 (3): 993–1000. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2005-12-5148

Descărcați fișierul de citare:

Abstract

Introducere

Leucemia limfocitară cronică cu celule B (CLL) reprezintă 25% din toate leucemiile și este cea mai frecventă formă de malignitate limfoidă din țările occidentale. 1 S-a demonstrat că tratamentul cu fludarabină analogică purinică, care este terapia standard curentă pentru LLC, crește rata de remisie completă, crește supraviețuirea fără progresie și crește durata mediană a răspunsului clinic, dar nu și supraviețuirea la pacienții netratați anterior. cu LLC, comparativ cu tratamentul cu clorambucil singur sau chimioterapie combinată. 2-4 Deși introducerea regimurilor combinate pe bază de fludarabină a îmbunătățit succesul general al tratamentului CLL, 5.6 identificarea terapiilor noi pentru CLL rămâne o prioritate ridicată.

CLL se caracterizează prin acumularea de limfocite CD5 + B de lungă durată care prezintă rezistență la apoptoză. Trifosfatul fludarabinei este încorporat în ADN-ul celulelor CLL în repaus în timpul sintezei ADN-ului reparator și induce leziuni ale ADN-ului. 7-9 Rupturile catenelor de ADN pot duce la activarea genelor țintă dependente de p53 și p53, 10,11 și sa sugerat că inducerea apoptozei mediată de p53 contribuie în primul rând la uciderea in vivo a celulelor CLL indusă de fludarabină. 11,12 De asemenea, sa raportat că fludarabina poate induce apoptoza celulelor CL in vitro într-un mod independent de p53, 13,14, deși semnificația in vivo rămâne necunoscută. 11,12 Din punct de vedere clinic, prezența mutațiilor p53 în celulele CLL este asociată cu scăderea supraviețuirii și rezistența la tratamentul cu fludarabină. 15-17

În acest studiu, am investigat utilizarea terapeutică potențială a activării p53 de către antagoniștii Mdm2 în LLC. Am constatat că (1) inhibarea Mdm2 induce în mod eficient apoptoza mediată de p53 în celulele CLL independent de nivelurile de expresie Mdm2 sau Atm, (2) apoptoza dependentă de transcripție nu poate fi întotdeauna modul principal prin care p53 induce apoptoza și că activarea exclusivă a calea independentă de transcripție poate induce pe deplin apoptoza și (3) Nutlin-3a și fludarabina induc sinergic apoptoza mediată de p53 în celulele CLL, care poate depăși rezistența la fludarabină în CLL.

Materiale și metode

Reactivi

Antagonistul selectiv al moleculei mici al MDM2, Nutlin-3a (furnizat cu amabilitate de Dr. Lyubomir T. Vassilev, Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), 27 și 9-β- d -arabinofuranosyl-2-fluoroadenină (F-ara- A, fludarabină) au fost utilizate. În unele experimente, celulele au fost cultivate cu cicloheximidă 3,5 μM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) sau Z-VAD-FMK 200 μM (Alexis, San Diego, CA). Cicloheximida și Z-VAD-FMK au fost adăugate la celule cu 1 oră înainte de administrarea medicamentului. Concentrația finală de dimetil sulfoxid (DMSO) în mediu nu a depășit 0,1% (vol/vol). La această concentrație, DMSO în sine nu a indus apoptoză până la 72 de ore în celulele CLL primare.

Eșantioane primare și culturi celulare

Probele de sânge periferic heparinizat au fost obținute de la pacienți CLL netratați anterior cu peste 70% celule maligne după consimțământul informat, în conformitate cu liniile directoare instituționale și Declarația de la Helsinki. Celulele mononucleare au fost purificate prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll-Hypaque (Sigma Chemical, St Louis, MO) și celulele neaderente au fost resuspendate în mediu RPMI 1640 suplimentat cu FCS 10% la o densitate de 5 × 105 celule/ml. Celulele au fost tratate cu Nutlin-3a sau F-ara-A, ambele la 1, 2,5, 5 sau 10 μM și au fost incubate timp de 72 de ore la 37 ° C și 5% CO2 într-o atmosferă umidificată. În experimentele combinate de Nutlin-3a și F-ara-A, cei 2 agenți au fost adăugați simultan la celule la un raport de concentrație fixă ​​(1: 1) și celulele au fost incubate timp de 72 de ore.

Analiza apoptozei

Evaluarea apoptozei prin analiza de legare a anexinei V - iodură de propidiu (PI) a fost efectuată așa cum a fost descris. 28 Extinderea apoptozei a fost cuantificată ca procent de celule pozitive ale anexinei V, iar extinderea apoptozei specifice medicamentului a fost evaluată prin următoarea formulă: procentul de apoptoză specifică = (test - control) × 100/(100 - control). În formulă, numeratorul este cantitatea reală de ucidere care a avut loc, iar numitorul este cantitatea potențială de ucidere care ar putea avea loc. Pentru a măsura potențialul membranei mitocondriale (ΔΨm), celulele au fost încărcate cu MitoTracker Red CMXRos (300 nM) și MitoTracker Green (100 μM; ambele de la Molecular Probes, Eugene, OR) timp de 1 oră la 37 ° C. ΔΨm a fost apoi evaluat prin măsurarea retenției CMXRos (fluorescență roșie) în timp ce se ajustează simultan pentru masa mitocondrială (fluorescență verde).

Analiza Western blot

Analiza Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior. 28 Au fost utilizați următorii anticorpi: policlonal anti-p53 de iepure (FL-393; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-fosfo-p53 de șoarece monoclonal (Ser 15, 16G8; Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Mdm2 monoclonal de șoarece (D-12; Santa Cruz Biotechnology); anti-Puma policlonal de iepure (Ab-1; EMD Biosciences, San Diego, CA); anti-Bax policlonal de iepure (BD Biosciences, San Jose, CA); anti-Atm policlonal de iepure (Ab-3; Oncogene Research, Cambridge, MA); și anti-β-actină monoclonală de șoarece (AC-74; Sigma Chemical).

Cuantificarea proteinei intracelulare prin citometrie în flux

Pentru detectarea intracelulară a p53, celulele au fost fixate cu 2% paraformaldehidă, permeabilizate cu 100% metanol răcit cu gheață și incubate timp de 1 oră la 4 ° C cu anticorpi izotiocianat de fluoresceină (FITC) - anticorp conjugat împotriva p53 sau controlul său izotipic (FITC-conjugat ) set de reactivi anticorpi p53; BD Biosciences). Implicarea modificării conformaționale a Bax a fost analizată prin intermediul unui anticorp îndreptat împotriva regiunii NH2-terminale a Bax (YTH-6A7; Trevigen, Gaithersburg, MD). 31 Fixarea celulară, permeabilizarea și colorarea cu anticorp primar sau un control izotipic au fost efectuate folosind kitul Dako IntraStain (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), conform instrucțiunilor producătorului. După spălare, celulele au fost incubate cu anticorpi secundari antimouse de pui Alexa Fluor 488 (sonde moleculare) timp de 30 de minute la 4 ° C.

Imunofluorescență și microscopie confocală

Imunofluorescența și examenul microscopic confocal au fost efectuate așa cum s-a descris anterior, 28 cu modificări minore. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, fixate cu paraformaldehidă 2% și permeabilizate cu metanol 100% răcit cu gheață. Celulele au fost blocate în ser normal de capră 5% timp de 30 de minute, urmată de incubare peste noapte la 4 ° C cu anticorpi policlonali anti-p53 de iepure FL-393 (1: 100 vol/vol; Santa Cruz Biotechnology) și anti-citocrom monoclonal de șoarece c oxidaza IV (10G8, 1 μg/mL; sonde moleculare). După spălare, celulele au fost incubate cu anticorp secundar antirabit Alexa Fluor 488 de pui și anticorp secundar antimouse Alexa Fluor 594 (probe moleculare) diluate în ser normal de capră 5% timp de 30 de minute la 4 ° C. Nucleii au fost contracolorați cu DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Imaginile au fost obținute folosind un obiectiv obiectiv de 60 ×/1,40 PlanApo pe un microscop confocal Olympus FV500 cu software-ul Fluoview versiunea 4.3 (Olympus, Melville, NY).

Transcriere inversă - reacție în lanț a polimerazei (RT-PCR) și secvențierea ADN a p53

Pe baza incidenței scăzute a mutației p53 și a asocierii raportate între starea p53 și răspunsul celulei la Nutlins, 27,28,32 analiza secvenței a p53 a fost efectuată în cazuri rezistente la Nutlin și în cazuri selectate sensibile la Nutlin. Metodologia a fost descrisă anterior. 28

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind testul Student t cu două cozi și coeficientul de corelație Pearson. Semnificația statistică a fost luată în considerare atunci când valorile P au fost mai mici de 0,05. Cu excepția cazului în care se indică altfel, valorile medii au fost exprimate ca medie plus sau minus SEM. Sinergismul, efectele aditive și antagonismul au fost evaluate așa cum s-a descris anterior. 28 Indicele de combinație (CI), o descriere numerică a efectelor de combinație, a fost calculat folosind presupunerea statistică mai strictă a modurilor de acțiune care nu se exclud reciproc. Când CI = 1, această ecuație reprezintă izobolograma de conservare și indică efecte aditive. Valorile CI mai mici de 1,0 indică un efect aditiv mai mult decât se aștepta (sinergism), în timp ce valorile CI mai mari de 1,0 indică antagonism între cele două medicamente.

Rezultate

Nutlin-3a induce apoptoza, care este îmbunătățită prin combinație cu F-ara-A, în celulele CLL

Caracteristicile pacientului

Tratamentul probelor primare de CLL cu Nutlin-3a sau F-ara-A determină apoptoza dependentă de doză și de timp, iar combinația lor prezintă efecte sinergice. Celulele din 30 de probe sensibile la Nutlin au fost incubate cu concentrațiile indicate de Nutlin-3a sau F-ara-A, iar fracțiunile pozitive ale anexinei V au fost măsurate prin citometrie în flux la 24 și 72 de ore. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM.

Tratamentul probelor primare de CLL cu Nutlin-3a sau F-ara-A determină apoptoza dependentă de doză și de timp, iar combinația lor prezintă efecte sinergice. Celulele din 30 de probe sensibile la Nutlin au fost incubate cu concentrațiile indicate de Nutlin-3a sau F-ara-A, iar fracțiunile pozitive ale anexinei V au fost măsurate prin citometrie în flux la 24 și 72 de ore. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM.

Valorile indicelui combinat pentru efectele apoptotice ale F-ara-A și Nutlin-3a

Valorile medii ale indicelui de combinație (Cl) au fost calculate din ED50, ED75 și ED90.

Stadiul incipient al inducerii apoptozei de către F-ara-A în celulele CLL in vitro este dependent de p53

S-a arătat că fludarabina depinde de inducerea apoptozei mediată de p53 pentru citotoxicitatea sa in vivo, dar gradul contribuției semnalizării p53 la potențialul apoptotic total al fludarabinei in vitro rămâne necunoscut. 11-14 Am corelat amploarea apoptozei indusă de 1, 2,5, 5 sau 10 μM Nutlin-3a cu cea indusă de aceeași concentrație molară de F-ara-A. Nivelurile de apoptoză indusă de F-ara-A corelate direct (r = 0,811; P 27,28 susceptibilități diverse ale probelor de celule la apoptoza indusă de Nutlin și activitatea apoptogenă independentă de p53 a F-ara-A la 72 de ore în cazuri mutante de p53, se pare că F-ara-A induce în primul rând apoptoza dependentă de p53 în primele 24 de ore și mai târziu prezintă activități dependente de p53 și independente de p53.

Corelația pozitivă a apoptozei induse de Nutlin-3a și F-ara-A în probele de pacienți cu CLL. Măsura apoptozei indusă de 1, 2,5, 5 sau 10 μM Nutlin-3a a fost corelată cu cea indusă de aceeași concentrație molară de F-ara-A în 30 de probe sensibile la Nutlin.

Corelația pozitivă a apoptozei induse de Nutlin-3a și F-ara-A în probele de pacienți cu CLL. Măsura apoptozei indusă de 1, 2,5, 5 sau 10 μM Nutlin-3a a fost corelată cu cea indusă de aceeași concentrație molară de F-ara-A în 30 de probe sensibile la Nutlin.

Nutlin-3a și F-ara-A induc sinergic p53 și activează Bax

Inducerea proteinelor legate de p53 de către F-ara-A și Nutlin-3a într-o probă CLL cu p53 de tip sălbatic. Proba conținea mai mult de 95% celule CD5 + CD19 + cu niveluri normale de Atm. Celulele au fost tratate cu 5 μM F-ara-A (F) și 5 μM Nutlin-3a (3a) fie ca agenți individuali, fie în combinație, pentru timpii indicați. F-ara-A a indus fosforilarea p53 pe Ser 15, urmată de acumularea p53 și inducerea Puma. Nutlin-3a a indus acumularea imediată de p53, care este în cea mai mare parte lipsită de fosforilare pe Ser 15, urmată de inducerea Mdm2 și Puma. Gradul de inducție Puma a fost îmbunătățit în continuare în celulele tratate cu F-ara-A și Nutlin-3a. β-Actina este utilizată pentru a confirma încărcarea egală a proteinelor. Lizat din celule înainte de tratament servit drept control (C).

Inducerea proteinelor legate de p53 de către F-ara-A și Nutlin-3a într-o probă CLL cu p53 de tip sălbatic. Proba conținea mai mult de 95% celule CD5 + CD19 + cu niveluri normale de Atm. Celulele au fost tratate cu 5 μM F-ara-A (F) și 5 μM Nutlin-3a (3a) fie ca agenți individuali, fie în combinație, pentru timpii indicați. F-ara-A a indus fosforilarea p53 pe Ser 15, urmată de acumularea p53 și inducerea Puma. Nutlin-3a a indus acumularea imediată de p53, care este în cea mai mare parte lipsită de fosforilare pe Ser 15, urmată de inducerea Mdm2 și Puma. Gradul de inducție Puma a fost îmbunătățit în continuare în celulele tratate cu F-ara-A și Nutlin-3a. β-Actina este utilizată pentru a confirma încărcarea egală a proteinelor. Lizat din celule înainte de tratament servit drept control (C).

Ambele căi de apoptoză dependente de transcripție și independente de transcripție sunt operaționale în apoptoza dependentă de p53 în CLL

Inhibitorul Mdm2 induce apoptoza independent de statutul Mdm2 sau Atm

Sinergismul între Nutlin-3a și F-ara-A este menținut în cazuri cu Atm scăzut. Rezultatele testului de legare a anexinei V în 30 de probe sensibile la Nutlin (Figura 1) au fost analizate separat în ceea ce privește nivelurile de expresie Atm. Celulele au fost incubate cu concentrațiile indicate de Nutlin-3a sau F-ara-A, iar fracțiunile pozitive ale anexinei V au fost măsurate prin citometrie în flux la 24 de ore. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. □ indică Nutlin-3a; ▦, F-ara-A; și ▪, combinație.

Sinergismul între Nutlin-3a și F-ara-A este menținut în cazuri cu Atm scăzut. Rezultatele testului de legare a anexinei V în 30 de probe sensibile la Nutlin (Figura 1) au fost analizate separat în ceea ce privește nivelurile de expresie Atm. Celulele au fost incubate cu concentrațiile indicate de Nutlin-3a sau F-ara-A, iar fracțiunile pozitive ale anexinei V au fost măsurate prin citometrie în flux la 24 de ore. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. □ indică Nutlin-3a; ▦, F-ara-A; și ▪, combinație.

Eficacitatea tratamentului combinat cu Nutlin-3a și F-ara-A este independentă de cazurile cu Atm scăzut

Pentru a determina dacă efectul apoptotic sinergic prin combinația Nutlin-3a și F-ara-A prezentată în Figura 1 se menține în cazuri cu Atm scăzut, datele la 24 de ore din 30 de probe sensibile la Nutlin au fost analizate separat între cazurile de Atm scăzut (n = 5) și cele cu Atm ridicat (n = 25). Așa cum se arată în Figura 7, valorile medii ale CI au fost similare între cazurile cu Atm scăzut (0,44) și cele cu Atm ridicat (0,69), sugerând că Nutlin-3a și F-ara-A acționează sinergic pentru a induce apoptoza în celulele CLL independente de stare ATM. De asemenea, am clarificat dacă efectul de combinație ar putea fi diferit între cazurile în care Nutlin-3a a indus apoptoză independentă de transcripție și cele cu predominanță a apoptozei dependente de transcripție. Valorile medii ale CI la 24 de ore în grupurile independente de transcriere și grupurile dependente de transcripție au fost 0,54 și, respectiv, 0,78. Se pare că sinergismul a fost menținut în mod similar în ambele subgrupuri.

Discuţie

Am constatat că fludarabina utilizează mecanisme dependente de p53 și independente de p53 pentru a induce apoptoza celulelor CLL într-un mod specific timpului. Fludarabina induce apoptoza dependentă de p53 în perioada timpurie timpurie (11,12. A fost de interes ca Nutlin-3a și F-ara-A să inducă apoptoza sinergic în celulele CLL. Sinergismul a fost evident la 24 de ore de tratament când F-ara- Un mecanism combinat dependent de p53 pentru a induce apoptoza. Tratamentul combinat al celulelor cu Nutlin-3a și F-ara-A a indus în mod cooperativ modificarea conformațională a p53 și Bax în p53 de tip sălbatic, dar nu și în celulele p53 mutante, susținând în continuare importanța p53 semnalizare pentru interacțiunea sinergică. Am constatat, de asemenea, că interacțiunea sinergică dintre Nutlin-3a și F-ara-A în inducerea p53 și apoptoză a fost menținută în cazurile cu niveluri scăzute de Atm, oferind o justificare suplimentară pentru această strategie de combinație în tratamentul LLC. păstrează p53 de tip sălbatic.

Prepublicat online ca Hârtie Blood First Edition, 16 martie 2006; DOI 10.1182/blood-2005-12-5148.

Sprijinit parțial de subvenții de la National Institutes of Health (AML-PO1) CA55164, CA49639, CA89346 și CA16672 și de catedra Paul și Mary Haas în genetică (MA) și de Fundația Kanae pentru viață și științe socio-medicale (2004) ), Fundația Memorială Mochida pentru Cercetări Medicale și Farmaceutice (2004) și Fundația Memorială Uehara (2004) (KK).

Costurile de publicare ale acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxei de pagină. Prin urmare, și numai pentru a indica acest fapt, acest articol este marcat prin prezenta „reclamă” în conformitate cu 18 U.S.C. secțiunea 1734.

Dr. Lyubomir T. Vassilev de la Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) a furnizat cu generozitate Nutlin-3a. Autorii recunosc doamna Rosemarie B. Lauzon și doamna Leslie R. Calvert de la Departamentul de transplant de sânge și măduvă, Universitatea din Texas M. D. Anderson Cancer Center, pentru asistența lor.

• Dieta maternă bogată în grăsimi induce hipertrofie cardiacă timpurie și modifică metabolismul cardiac în Sprague
• Transferul genei IL-15sIL-15Rα induce pierderea în greutate și îmbunătățește homeostazia glucozei la șoarecii obezi Gene
• Pierderea funcțiilor non-canonice KCC2 promovează apoptoza de dezvoltare a proiecției corticale
• Keto Top pastile dietetice chinezești Pastile dietetice - Revista Salon
• Cum să slăbești ca acest tip care a slăbit 66 de kg prin post intermitent; făcând 2 schimbări în ale lui