Această lucrare a fost susținută de un grant de cercetare acordat A.S.I.L. și FRAC de către Consiliul de Cercetare în Biotehnologie și Științe Biologice (Regatul Unit) și un doctorat susținut de Consiliul de Cercetare în Biotehnologie și Științe Biologice. bursă (către Z.A.) susținută parțial și de Laboratorul Central de Toxicologie AstraZeneca (Cheshire, Marea Britanie).

într-un

Primii doi autori au contribuit în mod egal la acest studiu.

Zeenat Atcha, Felino Ramon A. Cagampang, J. Anne Stirland, Ian D. Morris, A. Nigel Brooks, Francis JP Ebling, Martin Klingenspor, Andrew SI Loudon, Leptin acționează asupra metabolismului într-un mod dependent de fotoperiod, dar nu are niciun efect privind funcția de reproducere în hamsterul siberian de reproducere sezonieră (Phodopus sungorus)

Această lucrare a fost susținută de un grant de cercetare acordat A.S.I.L. și FRAC de către Consiliul de Cercetare în Biotehnologie și Științe Biologice (Regatul Unit) și un doctorat susținut de Consiliul de Cercetare în Biotehnologie și Științe Biologice. bursă (către Z.A.) susținută parțial și de Laboratorul Central de Toxicologie AstraZeneca (Cheshire, Marea Britanie).

Abstract

La mamiferele de sezon, cum ar fi hamsterul siberian, modificările în reproducere reglementate de fotoperioadă sunt asociate cu cicluri sezoniere majore ale metabolismului și ale aportului de alimente. Aceste ritmuri metabolice persistă la animalele castrate și, prin urmare, nu sunt dependente de modificările steroizilor gonadici (1, 2). În zilele lungi (LD), masa corporală este crescută datorită apetitului crescut și depunerii de grăsime corporală, dar după expunerea la zile scurte (SD), animalul prezintă un apetit în scădere și suferă o perioadă prelungită de 20 + săptămâni de pierdere în greutate (25 –30%), aproape în totalitate sub formă de rezerve epuizate de grăsime abdominală (1). La animalele expuse la fotoperioade scurte și simultan alimente restricționate pentru o perioadă prelungită, această rată de scădere în greutate este accelerată. Cu toate acestea, la refacerea hranei ad libitum, animalele își redobândesc greutatea, dar numai până în acel moment al ciclului de slăbire la care ar fi ajuns în mod normal în același timp în condiții de hrănire ad libitum în SD (3). Acest lucru caracterizează fenomenul set-point glisant sezonier pentru reglarea greutății corporale (= grăsime), prin care fotoperioada modifică acele mecanisme implicate în apărarea unei anumite greutăți corporale, indiferent de manipulările pe termen scurt ale aportului de alimente și ale echilibrului energetic.

Leptina, produsul genei ob derivate din țesutul adipos, a fost puternic implicată ca unul dintre principalele semnale periferice care controlează rezervele de grăsime corporală și apetitul la mamifere (4). Sistemul nervos central, în special hipotalamusul, este cunoscut ca fiind un loc major al acțiunii leptinei și aici forma activă a receptorului de leptină se colocalizează în circuite peptidergice implicate intim în echilibrul energetic (5). Se recunoaște acum că leptina poate juca, de asemenea, un rol important în reglarea funcției reproductive. Mutațiile acestei gene duc la obezitate primară și disfuncție reproductivă la om și șoareci (6, 7), ambii fiind inversați după tratamentul cu leptină murină recombinantă (7-9). La hamsterul siberian, expresia genei leptinei atât în ​​țesutul adipos alb, cât și în maro este puternic influențată de fotoperioadă, cu o reducere de 6 ori a expresiei în zile scurte (10). Aceste observații ridică întrebări importante cu privire la rolul pe care îl pot avea modificările sezoniere ale căii de semnalizare a leptinei în reglarea ciclului anual de metabolism și reproducere.

Materiale și metode

Animale

Toate procedurile pentru animale au fost autorizate în temeiul Legii privind animalele (procedurile științifice) din 1986, Regatul Unit. Studiile au fost efectuate pe hamsteri siberieni (Phodopussungorus; Wright’s din Essex, Chelmsford, Marea Britanie) dintr-o colonie crescută la Universitatea din Manchester și derivată din animale descrise anterior (11). Animalele au fost ținute în condiții controlate (temperatura, 21 ± 1 C; umiditate, 80%) și au fost furnizate cu chow pentru rozătoare (Special Diet Service, Witham, Marea Britanie) și apă ad libitum. Animalele experimentale au fost adăpostite individual în camere de mediu controlate de lumină, iluminate cu o bandă albă fluorescentă de 70 wați (100-400 lux) cu lumină roșie continuă slabă (m PBS și administrate printr-o minipompă osmotică (capacitate de 100 μl; model Alzet 1007D, Charles River Laboratories UK Ltd., Kent, Marea Britanie) pentru a livra o concentrație de 15 μg/zi pentru o perioadă de 7 zile. Animalele de control au primit vehicul PBS singur. Pompele au fost implantate sc în regiunea scapulară prin procedură chirurgicală sterilă sub halotan (Fluotan, AstraZeneca Ltd., Cheshire, Marea Britanie) anestezie.

Protocoale experimentale

Exp 2: stabilirea unui model de clemă de steroizi la hamsterii feminini ovariectomizați. Hamsterii femele de paisprezece săptămâni crescute în condiții LD au fost ovariectomizate (OVX) și 2 săptămâni mai târziu au fost implantate sc în regiunea scapulară cu un implant care conține estradiol (E2). Fabricarea implanturilor E2 a fost descrisă anterior (14). Pe scurt, implanturile au fost realizate prin amestecarea unei game de doze de estrogen (1,3,5 [10] -estratriene-3,17β-diol; Sigma-Aldrich Corp. Ltd., Dorset, Marea Britanie) cu elastomer marca SILASTIC și un agent de întărire (Merck Ltd., Dorset, Marea Britanie) pentru polimerizarea elastomerului. După întărire, implanturile au fost tăiate la pătrate de 4 × 4 mm și au conținut doze estimate de estrogen de 0, 31, 62, 125, 250 și 500 μg/implant. Un total de șase animale pe doză au fost angajate și comparate cu un grup de șase controale ovare-intacte. La trei săptămâni după implantare, animalele au fost ucise prin luxația colului uterin și s-au cântărit uteri fără grăsimi.

Pentru a defini impulsul fotoperiodic pe secreția LH în modelul castrat, implantat cu steroizi, o cohortă suplimentară de femele de 16 săptămâni a fost împărțită în trei grupuri. Acestea au fost ovariectomizate și tratate cu un implant gol (OVX), ovariectomizate și implantate cu cea mai mică (31 μg) doză de E2 (OVX + E2), sau lăsate intacte și tratate cu un implant gol (INT). Toate animalele au fost adăpostite individual sub o fotoperioadă SD sau LD (șase pe tratament pe fotoperioadă) la 2 săptămâni după operație și în următoarele 12 săptămâni s-au efectuat măsurători săptămânale ale greutății corporale, aportului de hrană și scorului de pelaj pentru a valida un răspuns fotoperiodic SD . La sfârșitul săptămânii 12, animalele au fost ucise, iar hipofiza a fost disecată rapid, înghețată în gheață uscată și depozitată la -80 C înainte de testul LH. Au fost disecate și cântărite depozite de uter și perechi retroperitoneale perechi. Implanturile de 31 μg descrise mai sus au fost utilizate în toate experimentele ulterioare.

Exp 3: perfuzie de leptină la hamsterii feminini cu cleme steroizi în LD și SD. Douăzeci și patru de hamsteri de 16 săptămâni cu greutate potrivită cu hamsterii OVX implantați cu steroizi crescuți anterior în LD au fost adăpostiți individual și expuși la condiții LD sau SD pentru o perioadă de 8 săptămâni. Măsurătorile săptămânale ale greutății corporale, ale consumului de alimente și ale scorului pelage au fost efectuate în săptămânile 0-8. În săptămânile 9-11, fiecare animal a primit o pompă osmotică conținând fie leptină, fie PBS așa cum s-a descris mai sus (șase animale pe grupă per tratament). Pompele au fost înlocuite după o săptămână pentru o perioadă suplimentară de 1 săptămână. Din săptămânile 9-11, s-au înregistrat modificări zilnice ale aportului alimentar și ale greutății corporale. În ziua 14, hamsterii au fost anesteziați, iar probele de sânge au fost prelevate prin puncție cardiacă pentru determinarea leptinei serice. Animalele au fost ucise prin dislocare cervicală, iar hipofiza a fost îndepărtată rapid, înghețată în gheață uscată și depozitată la -80 C înainte de testul LH. Depozitele de grăsime retroperitoneală și uterele au fost disecate și cântărite.

Omogenizare hipofizară și teste hormonale

Prelucrarea hipofizelor. Fiecare hipofiză a fost omogenizată timp de 2 minute într-o soluție de 50 m m carbonat de sodiu (pH 7,4) conținând 1% Triton-X 100 și apoi lăsată să stea timp de 30 min. O alicotă de 50 μl a fost îndepărtată pentru determinarea proteinei hipofizare prin testul Bradford (15). Omogenatul rămas a fost centrifugat la 10.000 × g timp de 30 min și supernatantul a fost colectat pentru determinarea concentrației de LH.

LH. S-a folosit un dublu anticorp RIA pentru a determina concentrația de hipofiză LH, așa cum a fost descris anterior pentru utilizare la hamsteri (16). Reactivii RIA au fost furnizați de Programul Național de Hormoni și Hipofiză (NIDDK, Bethesda, MD) și au folosit anticorp S-11 antirat LH de iepure și preparat de referință LH RP-3 de șobolan. Concentrația medie minimă de LH detectată în omogenatul hipofizar a fost de 0,156 ng/ml, iar coeficienții de variație intra și interanaliză au fost de 4% și 17% pentru grupurile de omogenate la 2,8 și respectiv 1,4 ng/ml. Diluțiile hipofizare pe un interval de 16 ori (1: 8-1: 128) au prezentat un paralelism clar (datele nu sunt prezentate). Concentrația de LH a fost convertită în nanograme de LH per μg de concentrație de proteine ​​hipofizare. Nu am efectuat teste LH serice, deoarece am fost constrânși de volumul seric necesar pentru testul leptinei.

Testosteronul. Nivelurile serice de testosteron au fost determinate prin test imunosorbent legat de enzime, așa cum este descris pentru utilizare la această specie (17). Toate probele au fost incluse într-un singur test. Eficiența extracției a fost de 81%, iar limita de detecție a fost de 0,05 ng/ml. Coeficientul de variație intra-test pe baza replicilor grupului seric a fost de 12,9%.

Leptina. Concentrațiile serice de leptină au fost determinate printr-o imunoanaliză enzimatică sandwich în fază solidă utilizând leptină murină antirecombinantă de iepure purificată prin afinitate imobilizată în godeuri de microtitrare (18). Leptina legată a fost detectată cu anticorp policlonal antimurinic purificat prin afinitate conjugat cu peroxidază de hrean și cuantificat cu o substanță cromogenă. Concentrațiile de leptină au fost calculate din curbele standard generate pentru fiecare placă de microtitrare utilizând leptină murină recombinantă. Limita de detecție pentru test a fost de 0,15 ng/ml, iar coeficienții de variație intra și inter-test au fost de 4,5%, respectiv 8%, determinați din martorii interni de leptină murină. Datorită naturii heterologice a standardelor de leptină, concentrațiile serice de leptină măsurate sunt relative și nu neapărat absolute. Probele de ser au fost întotdeauna testate la trei diluții în duplicat și cu două diluții care se încadrează în mod normal în domeniul curbei standard. Comparația concentrațiilor calculate ale celor două diluții din fiecare hamster a demonstrat că valorile au variat între ele cu cel mult 13%.

Analiza datelor

Datele parametrice au fost analizate de ANOVA urmate de un test post-hoc Student-Newman-Keuls. Datele neparametrice au fost analizate prin testul Kruskal-Wallis urmat de testul post-hoc al lui Tukey. Răspunsurile timp-curs au fost analizate prin măsuri repetate ANOVA. Toate analizele au fost efectuate folosind un pachet statistic (SigmaStat, SPSS, Chicago, IL). Rezultatele sunt prezentate ca medie ± sem. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la P Fig. 1). Într-un studiu ulterior utilizând doza de 31 μg, concentrațiile hipofizei de LH au fost modulate semnificativ prin fotoperioadă (P = 0,018, cu ANOVA cu două căi). La animalele OVX expuse la LD, a existat o semnificativă (P Fig. 2). Toate grupurile de animale SD au prezentat un răspuns fotoperiodic robust al pierderii în greutate (P Fig. 3. A existat un efect semnificativ atât al fotoperiodului, cât și al tratamentului cu estrogeni asupra greutății corporale (fotoperioada, P = 0,003; estrogen, P sem. *, P sem. *, P sd (▪) fotoperioade. Valorile sunt media ± sem. *, P sd (▪) fotoperioade. Valorile sunt media ± sem. *, P sem.

Efectele fotoperioadei LD sau SD asupra consumului săptămânal de alimente (panourile superioare) și a greutății corporale (panourile inferioare) la hamsterii INT, OVX și OVX + E2 (n = 6/grup). Valorile sunt media ± sem.

Concentrațiile serice de leptină

Efectul tratamentului cu leptină de 14 zile (□) asupra greutății testiculare (a) și testosteronului seric (b) la hamsterii masculi păstrați fie în fotoperioade SD, fie LD. Valorile sunt media ± sem.

Efectul tratamentului cu leptină de 14 zile (□) asupra greutății testiculare (a) și testosteronului seric (b) la hamsterii masculi păstrați fie în fotoperioade SD, fie LD. Valorile sunt media ± sem.

Efectul tratamentului cu leptină de 14 zile (□) asupra concentrației hipofizare LH la hamsterii masculi (a) și OVX + E2 femele (b) păstrați fie în fotoperioade SD, fie LD. Valorile sunt media ± sem.

Efectul tratamentului cu leptină de 14 zile (□) asupra concentrației hipofizare LH la hamsterii masculi (a) și OVX + E2 femele (b) păstrați fie în fotoperioade SD, fie LD. Valorile sunt media ± sem.

Discuţie

Datele noastre arată că apetitul fotoperiodic sezonier și ciclul de greutate al hamsterului siberian sunt asociate cu modificări semnificative ale concentrațiilor serice măsurate de leptină, care urmăresc modificările depozitelor de grăsime intraabdominale. Modificările mediate de fotoperioadă ale metabolismului și ale secreției de leptină raportate aici sunt observate atât la femele cu cleme steroizi, cât și la bărbații intacti la gonade și, prin urmare, trebuie considerate ca fiind independente de modificările sezoniere ale nivelurilor de steroizi sexuali. În mod curios, animalele cu cleme steroizi adăpostite de SD au prezentat o perioadă inițială de creștere în greutate timp de 2-3 săptămâni înainte de pierderea în greutate, în contrast marcat cu femelele castrate, care au pierdut în greutate pe parcursul perioadei de expunere la SD. Atribuim acest lucru posibilului efect anabolic al dozei de estrogen utilizată la animalele fixate cu steroizi.

Pe scurt, datele noastre demonstrează diferențe fotoperiodice clare în sensibilitatea metabolică a hamsterilor siberieni la infuzia de leptină, care sunt independente de suprimarea consumului de alimente, ceea ce implică o acțiune directă a acestui hormon asupra termogenezei și a consumului de energie. Eșecul acestui hormon de a reactiva axa reproductivă fotoinhibită sugerează cu tărie că căile implicate în suprimarea sezonieră a reproducerii prin semnalul melatoninei sunt diferite de cele implicate în răspunsurile proximale la aportul de nutrienți pe termen scurt și feedback-ul leptinei.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc lui Margery Nicholson și colegilor de la Amgen, Inc., pentru furnizarea de leptină și determinarea RIA a concentrațiilor de leptină, Programului Național de Hormoni și Hipofiză (Bethesda, MD) pentru furnizarea reactivilor LH RIA și Dr. Richard Preziosi pentru sfaturi statistice.