Dovezi ale unui ciclu de feedback pozitiv Leptină-Colecistochinină

  1. Sandra Guilmeau,
  2. Marion Buyse,
  3. Annick Tsocas,
  4. Jean Pierre Laigneau și
  5. André Bado

  1. De la Institutul Național al Sănătății și Cercetării Medicale (INSERM) Unité 410, Facultatea de Medicină Xavier Bichat, Paris, Franța
  1. Adresați cererile de corespondență și retipărire către Andre Bado, INSERM Unité 410, Facultatea de Medicină Xavier Bichat, 16, rue Henri Huchard, 75018 Paris, Franța. E-mail: badobichat.inserm.fr .

Dovezi ale unui ciclu de feedback pozitiv Leptină-Colecistochinină

Abstract

  • CCK, colecistochinina
  • ERK, kinază extracelulară legată de semnal
  • ERK-P, fosfo-ERK
  • INSERM, Institutul Național al Sfântului și al Cercetării Medicale
  • IR, imunoreactiv
  • MAPK, o proteină kinază activată cu mitogen
  • MEK, cinema MAPK
  • PI3-K, fosfoinozidă 3-kinază
  • RIA, radioimunotest
  • STAT, traductoare de semnal și activatori de transcriere.

Leptina, produsul genei ob, a fost raportată inițial ca fiind produsă de celulele adipoase (1). Este eliberat în fluxul sanguin și transportat prin bariera hematoencefalică în hipotalamus, unde activează receptori specifici de leptină (2,3) și reglează homeostazia energetică modificând aportul și cheltuielile de energie (4-6). Leptina reglează consumul de alimente prin mecanisme care implică discuții încrucișate între receptorii hipotalamici ai leptinei și diferite neuropeptide implicate în controlul hrănirii. Receptorul leptinei (Ob-R) este un membru al familiei gp130 de receptori de citokine. Apare în mai multe izoforme rezultate din îmbinarea alternativă a genei receptorului de leptină db (2,3). În prezent, se crede că izoforma lungă, Ob-Rb, poate activa traductoarele de semnal și activatorii căilor de transcripție (STAT), în timp ce atât Ob-Rb, cât și isoforma scurtă (Ob-Ra) pot transduce semnale prin substraturile receptorilor de insulină și prin căi de proteină kinază activată cu mitogen (MAPK) (7).

leptina

Semnalele care apar din tractul gastro-intestinal superior în timpul hrănirii sunt transmise creierului de nervul vag. Aceste semnale sunt componente cheie în controlul sațietății induse de masă. Colecistochinina (CCK) este secretată de celulele endocrine I duodenale și funcționează de obicei ca unul dintre aceste semnale de satietate pe termen scurt (8,9). Interesant este faptul că inhibarea indusă de leptină a consumului de alimente (10) și stimularea secrețiilor exocrine pancreatice (11) pot fi blocate de un antagonist al receptorilor CCK-1. Aceste date sugerează că CCK endogen este implicat în aceste efecte, funcționând prin receptorii CCK-1. Cu toate acestea, nu se știe în prezent dacă leptina modulează direct eliberarea CCK.

Leptina este produsă și de stomac (12-14) și este secretată în principal în sucul gastric după CCK la șobolani (12,15) și după secretină sau stimulare vagală la om (14,16). O parte din leptina derivată din stomac nu este pe deplin degradată prin proteoliză, indicând faptul că ajunge la intestin într-o formă activă și, astfel, poate iniția procese biologice care controlează funcțiile tractului intestinal. Într-adevăr, leptina lumenală crește activitatea transportorului dependent de protoni la marginea periei, PepT1, care îmbunătățește absorbția intestinală a oligopeptidelor (17). Acest lucru crește posibilitatea ca leptina să moduleze și activitatea secretorie a celulelor endocrine intestinale, cu condiția ca leptina să fie prezentă în sucul intestinal.

În acest studiu, am examinat efectele in vitro ale leptinei recombinante asupra eliberării CCK și am investigat mecanismele intracelulare ale acțiunii leptinei în celulele STC-1 care secretă CCK. Am emis ipoteza că leptina care ajunge în duoden este capabilă să moduleze eliberarea CCK. Pentru a testa această ipoteză, am stabilit dacă leptina era prezentă în sucul duodenal și apoi am examinat efectul in vivo al eliberării directe duodenale de leptină asupra concentrațiilor plasmatice de CCK în modelul perfuzat duodenal de șobolan. Am pus sub semnul întrebării relevanța fiziologică a datelor prin analiza modelelor cinetice in vivo ale concentrațiilor plasmatice și insulinei CCK și prin analiza conținutului de leptină din stomac după consumul de alimente la șobolanii Zucker. În cele din urmă, am investigat efectele in vivo ale antagoniștilor receptorilor CCK asupra modificărilor induse de hrănire a acestor parametri.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Cultură de celule.

Celulele STC-1 (un cadou de la Dr. J. Abello, Institutul Național al Sănătății și Cercetării Medicale [INSERM] U-45, Lyon, Franța) sunt derivate din linii de celule tumorale endocrine intestinale dezvoltate de la șoareci care exprimă transgenul pentru promotorul insulinei de șobolan legat de virusul simian 40 antigen T mare și virusul polioma antigen t mic (18). Celulele STC-1 între pasajele 15 și 35 au fost crescute în RPMI-1640 plus glutamină (Sigma, St Louis, MO), suplimentate cu 5% ser fetal bovin, 100 unități/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină, Life Technologies, Grand Island, NY) într-o atmosferă umidificată conținând 95% O2 și 5% CO2 la 37 ° C.

Analiza RT-PCR a receptorilor de leptină.

ARN-ul total a fost extras din celulele STC-1 cu reactivul Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pe scurt, ADNc din prima catenă a fost sintetizat din 2 μg ARN total și a fost transcris invers cu 200 de unități de transcriptază inversă folosind kitul Superscript II (Invitrogen) conform recomandărilor producătorului. Următorii primeri oligonucleotidici au fost sintetizați de Sigma Genosys (Cambridgeshire, Marea Britanie): primerul direct pentru Ob-Rb a fost 5′-ATGAAGTGGCTTAGAATCCCTTCG-3 ′ și primerul invers a fost 5′-ATATCACTGATTCTGCATCCTG-3 ′. Primerii utilizați pentru gena β-actină au fost după cum urmează 5'-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3 'și 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATCCTG-3'. Probele au fost denaturate prin încălzire la 95 ° C timp de 3 minute. PCR a fost apoi efectuată în condițiile descrise anterior (14). Produsele PCR au fost separate prin electroforeză într-un gel de agaroză 2%. Gelul a fost colorat cu bromură de etidiu și privit sub iluminare ultravioletă. Mărimile preconizate ale produselor PCR au fost de 375 pb pentru Ob-Rb și 606 pb pentru β-actină.

Analiza Western blot.

Pentru extracția totală a proteinelor, peletele celulare STC-1 au fost omogenizate la 4 ° C în tampon de liză suplimentat cu 0,1 mg/ml fluorură de fenilmetilsulfonil, 100 μmol/l aprotinină și 100 mmol/l NaVO4. Omogenatele au fost centrifugate la 15.000 g timp de 30 de minute la 4 ° C și supernatanții au fost colectați pentru analiza Western blot. Concentrația de proteine ​​a fost cuantificată utilizând testul proteinei Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Pe scurt, proteinele solubilizate au fost rezolvate prin electroforeză pe 7,5% geluri SDS-PAGE. Proteinele rezolvate au fost transferate pe membrane de nitroceluloză și supuse analizei imunoblotului cu un antiser policlonal Ob-Rb crescut la iepure împotriva unei peptide COOH-terminale a receptorului de leptină (aminoacizi 890-903) specific izoformei Ob-Rb (OBR 12 -A; Biotrend Chemicals, Köln, Germania) diluat 1: 750. După o incubare de 1 oră a membranelor cu peroxidază de hrean anti-iepure - anticorp conjugat (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) diluat 1: 1.000, complexele imune au fost detectate prin chemiluminescență îmbunătățită (Pierce, Rockford, IL).

Imunocitochimie.

Celulele STC-1 au fost însămânțate în lamele de sticlă Lab-Tek II cu 4 godeuri (Nalge Nunc International, Naperville, IL). După 2 zile de incubație la 37 ° C cu 95% O2: 5% CO2, mediul a fost îndepărtat și celulele au fost spălate de două ori în PBS rece. Am adăugat apoi un fixativ pentru formalină (4% paraformaldehidă) și am incubat celulele timp de 10 minute. Celulele au fost apoi digerate cu 0,1% pepsină în HCI 0,01N, pH 2,25, timp de 10 minute pentru a extrage antigenul. Înainte de imunoreacție, activitatea endogenă a peroxidazei a fost îndepărtată prin adăugarea de 0,3% H2O2 și incubarea timp de 5 min. Celulele au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu un antiser policlonal Ob-Rb de iepure (OBR 12-A) sau un antiser policlonal Ob-R (TP283) crescut la iepure împotriva unei peptide NH2-terminale a receptorului de leptină (aminoacizi 25-208 ) (Clinisciences, Montrouge, Franța) sau cu un anticorp anti-iepure anti-CCK8 (Sigma), fiecare dintre aceștia fiind diluat 1: 100. Lamele au fost apoi incubate 1 oră la temperatura camerei cu un anticorp anti-iepure de porc urmat de un complex peroxidază-antiperoxidază de iepure Z0113 (Dako, Carpinteria, CA), fiecare diluat 1: 100. Colorarea imunohistochimică a fost efectuată folosind clorhidrat de 3 ', 3'-diaminobenzidină ca cromogen peroxidază (Sigma).

Controale.

Nu s-a observat imunocolorare în celulele STC-1 atunci când în următoarele condiții: 1) ser normal de iepure utilizat în locul serului de iepure imun și 2) incubarea prealabilă a antiserului Ob-Rb (OBR 12-A) cu 20 μg peptidă de control 12- P) pe mililitru de antiser diluat timp de 3-4 ore la temperatura camerei.

Fosforilarea kinazei legate de semnal extracelular (ERK).

Peste noapte, culturile de celule STC-1 înfometate cu ser au fost incubate mai întâi timp de 30 de minute la 37 ° C cu vehicul, cu 10 μmol/l PD98059 (un inhibitor selectiv al activității MAPK kinazei [MEK]), sau cu 1-10 μmol/l wortmannin (un inhibitor al fosfoinozidei 3-kinazei [PI3-K]). Apoi, vehicul (control), 100 nmol/l leptină de șoarece (R&D Systems, Minneapolis, MN) sau bombesină (Sigma) a fost adăugată la celule și incubată în continuare timp de 1 oră. Probele de proteine ​​extrase solubilizate (80 μg) au fost rezolvate prin electroforeză pe geluri SDS-PAGE 12,5% așa cum s-a descris. Bloturile au fost sondate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi policlonali de iepure: anti - ERK-1/2 MAPK (pTpY185/187) fosfospecific (Biosource Europe, Nivelles, Belgia) diluat 1: 1.000. Aceleași membrane au fost apoi dezbrăcate și imunoblotate cu un antiser ERK-1 (Santa Cruz Biotechnology) diluat 1: 500 pentru a determina proteinele totale MAPK. Complexele imune au fost detectate prin chemiluminescență sporită (Pierce). Imunoblotii au fost cuantificați utilizând analiza imaginii NIH (Scion Corporation), iar rezultatele au fost exprimate ca raport dintre fosfo-ERK (ERK-P) și ERK total.

Studii secretorii CCK in vitro.

Celulele STC-1 au fost însămânțate pe plăci de cultură cu 12 godeuri (5 x 104 celule/godeu). Când celulele au atins confluența de 80%, mediul a fost îndepărtat și culturile monostrat de celule STC-1 au fost spălate de două ori cu PBS. Apoi, mediul de cultură suplimentat cu leptină murină sau bombesină a fost adăugat la celule și incubat la 37 ° C în 95% CO2 timp de 1 oră. Supernatanții au fost colectați și congelați la -20 ° C. Conținutul celulelor a fost extras în 2 mol/l CH3COOH - 20 mmol/l HCI, sonicat, fiert timp de 10 min, ajustat la pH 7 cu 1 mol/l NH3 și congelat la -20 ° C. CCK a fost determinat în supernatante și extracte de celule prin radioimunotest (RIA).

Într-un alt set de experimente, celulele STC-1 au fost preincubate timp de 30 min la 37 ° C cu 10 μmol/l PD98059, un inhibitor selectiv al activității MEK, sau 10 μmol/l wortmannin, un inhibitor PI3-K, înainte de adăugarea de vehicul (control) sau leptină. O oră mai târziu, supernatantele au fost îndepărtate și utilizate pentru determinarea CCK de către RIA.

Animale.

Șobolanii masculi Wistar cu o greutate de 260-280 g și șobolanii masculi obezi (fa/fa) și slabi (Fa/fa) Zucker de sex masculin (Iffa Credo, Les Oncins, L'Arbresle, Franța) au fost cușcați în condiții de laborator standard cu apă de la robinet și alimente obișnuite furnizate ad libitum, într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore/12 ore la o temperatură de 21-23 ° C. Animalele au fost tratate în conformitate cu standardele Comitetului European privind îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.

Determinarea leptinei în suc duodenal și cromatografia de excludere a mărimii.

Șobolanii hrăniți ad libitum sau șobolanii care au fost lipsiți de hrană timp de 24 de ore au fost anesteziați și un cateter de evacuare a fost implantat chirurgical la 1 cm sub ligamentul Treitz pentru colectarea sucului duodenal timp de 60 de minute după injectarea intravenoasă (prin vena femurală) de soluție salină sau 30 μg/kg carbachol (Sigma, St. Louis, MO). PH-ul a fost măsurat și leptina a fost determinată de RIA. O probă de suc duodenal sau leptină murină a fost supusă cromatografiei de excludere a dimensiunii utilizând coloana Superdex 200 (16/60) (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germania). Coloana a fost echilibrată cu PBS conținând 0,1% BSA și 0,01% azidă de sodiu la 4 ° C la un debit de 2 ml/min. Volumul eșantionului aplicat a fost de 5 ml, iar fracțiile de 2 ml au fost colectate și depozitate la -20 ° C până la leptină RIA. Coloana a fost ajustată cu seturi de proteine ​​de calibrare disponibile în comerț (Pharmacia Biotech).

Studii de perfuzie duodenală.

Studiile de perfuzie duodenală au fost efectuate pe șobolani care au fost lipsiți de hrană timp de 24 de ore, cu apă disponibilă ad libitum. Șobolanii au fost anesteziați cu etiluretan (1,2 g/kg, intramuscular) (Prolabo, Paris, Franța), iar după laparotomie, o canulă de intrare transpylorică a fost introdusă în duoden și o canulă de ieșire a fost introdusă la aproximativ 1 cm sub ligamentul lui Treitz. Segmentul duodenal a fost perfuzat la un debit de 4 ml la fiecare 15 minute cu un tampon Krebs-Ringer format din următoarele (în mmol/l): 0,5 MgCl2, 4,5 KCl, 120 NaCl, 0,7 NaHPO4, 1,5 NaH2PO4, 1,2 CaCl2, 15 NaHCO3 și 10 glucoză ajustate la pH 7,5. Soluția a fost menținută la 37 ° C printr-un strat de apă înainte de intrarea sa în segmentul duodenal. După o perioadă de stabilizare de 15 minute, s-a adăugat un vehicul care conține BSA ca proteină nespecifică sau leptină murină (1-100 nmol/l) în soluția de perfuzie. Probele de sânge au fost colectate printr-un cateter carotidian în tuburi care conțin EDTA așa cum s-a descris anterior (11) și au fost centrifugate la 10.000 g timp de 3 minute. Plasma a fost îndepărtată și speedVac concentrat după o extracție cu etanol și depozitat la -20 ° C până la CCK RIA.

Efectele hrănirii singure sau în asociere cu antagoniști ai receptorilor CCK asupra nivelului de leptină din stomac, insulină plasmatică și niveluri de CCK.

Șobolanii masculi Wistar sau Zucker erau obișnuiți să-și mănânce regimul de pelete între orele 10:00 a.m. și 18:00 când mâncarea era retrasă până a doua zi dimineața, dar apă era disponibilă ad libitum.

În ziua experimentului, începând de dimineață (10:00 dimineața), animalelor li s-a permis să se hrănească cu o dietă standard de laborator, pre-cântărită, pentru diferite perioade de timp. La fiecare perioadă, alimentele au fost cântărite și s-a determinat aportul. Șobolanii au fost anesteziați, sângele a fost colectat din aorta abdominală și centrifugat și plasma a fost îndepărtată și depozitată la -20 ° C până la RIA de CCK și insulină (Kituri RIA; Linco Research, St. Charles, MO). Stomacul a fost îndepărtat și deschis. Conținutul său a fost colectat și centrifugat, iar supernatantele au fost îndepărtate și depozitate la -20 ° C până la testarea leptinei în suc gastric de către RIA. Mucoasa fundică a fost eliminată, cântărită, omogenizată și centrifugată 10.000 g timp de 10 minute, după cum s-a descris anterior. Supernatantele au fost utilizate pentru determinarea leptinei gastrice.

Pentru studiile antagoniste, cu 10 minute înainte de consumul de alimente, animalele au fost injectate intraperitoneal cu vehicul (control) sau 1 mg/kg L364718 (un cadou de la profesorul B. Roques, INSERM 266, Paris, Franța) sau YM022 (un cadou de la Yamanouchi Pharmaceutical, Tokyo), antagoniști ai receptorilor CCK-1 și respectiv CCK-2, în ser fiziologic conținând 1% DMSO. După 15 minute de aport alimentar, s-au determinat insulina plasmatică, CCK plasmatică, conținutul de leptină stomacală și eliberarea de leptină.

RIA al CCK.

CCK a fost determinat în conformitate cu procedura descrisă de Rehfeld (19). Pe scurt, anticorpul anti-CCK terminal COOH (un cadou de la profesorul J. Rehfeld, Copenhaga, Danemarca) a fost incubat la 4 ° C timp de 4 zile cu CCK-8 (Sigma) sau cu probe de plasmă și [125 I] CCK- 8 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) în tampon RIA constând din 20 mmol/l tampon barbital, 0,6 mmol/l tiomersal și 0,11% BSA vol/vol (pH 8,4). Fracțiile legate și libere au fost separate prin absorbția CCK-8 liberă [125 I] pe cărbune activ dextran T70 (4 și respectiv 40 g/l) în tampon RIA conținând 10% ser de cal filtrat. Radioactivitatea în fracția legată a fost măsurată cu un contor gamma. În aceste condiții, limita de detectare a fost de 0,5 pg CCK.

analize statistice.

Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE. Au fost comparate cu ANOVA unidirecțional, urmate de un test de comparație multiplă Tukey-Kramer dacă s-au obținut rezultate semnificative.

REZULTATE

Celulele STC-1 exprimă receptori de leptină.

Analiza RT-PCR și Western blot au fost utilizate pentru a studia expresia receptorilor de leptină în celulele STC-1 producătoare de CCK. A fost detectat un produs de 375 bp, corespunzător pozițiilor 2401-2776 ale Ob-Rb (Fig. 1A). După secvențierea ADNc, s-a constatat că acest produs este 100% identic cu transcrierea genei Ob-Rb de la șoarece.

Imunoblotarea extractelor de proteine ​​STC-1 cu un anticorp anti - Ob-Rb a detectat două benzi imunoreactive (IR) cu mase moleculare relative de 130 și 170-kDa (Fig. 1B). Banda proeminentă IR de 130 kDa a corespuns izoformei lungi a receptorului de leptină pe baza greutății moleculare prevăzute, iar banda de 170 kDa a corespuns probabil unei forme glicozilate de Ob-Rb. Studiile imunocitochimice (Fig. 1C și D) folosind un anticorp care recunoaște toate izoformele receptorilor de leptină au arătat imunoreactivitatea receptorilor de leptină distribuită difuz în citoplasmă cu colorare puternică pe membranele unor celule (Fig. 1C). Utilizarea unui antiser specific pentru Ob-Rb a dat o distribuție similară a receptorilor de leptină în celulele STC-1 (Fig. 1D).

Leptina stimulează eliberarea CCK din celulele STC-1.

Imunomarcarea celulelor STC-1 cu un anticorp specific anti-CCK a arătat că 90% din celule conțin CCK (date neprezentate), ceea ce este în concordanță cu rezultatele studiilor anterioare (20). Conținutul mediu de CCK celular a fost de 1.308 ± 101,5 pmol/l (n = 16), iar nivelul bazal al eliberării CCK peste 1 oră (24,9 ± 6,2 pmol/l, n = 16) a reprezentat 1,9% din conținutul total de CCK de celulele.

A: Exprimarea receptorilor de leptină pe celulele STC-1. ARN-ul total extras din celulele STC-1 a fost testat pentru Ob-Rb prin RT-PCR așa cum este descris în proiectarea și metodele de cercetare. Electroforeza pe gel de agaroză a produselor PCR a fost generată cu primerii specifici pentru izoforma lungă (Ob-Rb) a genei receptorului de leptină. Banda 1: scară ADN marker; banda 2: celule STC-1; banda 3: control negativ în care transcriptaza inversă a fost omisă; banda 4: β-actină. Mărimile preconizate ale produselor PCR au fost de 375 bp pentru Ob-Rb și 606 bp pentru β-actină (săgeți). B: Analiza Western blot a extractelor de celule STC-1 la pasajul 15 (banda 1), 25 (banda 2) și 35 (banda 3), cu un anticorp specific anti-Ob-Rb (OBR 12-A). Un imunoblot reprezentativ este prezentat pentru receptorul de leptină, prezentând două proteine ​​IR, cu dimensiuni de 130 și 170 kDa. Rețineți că cantitatea de proteină a receptorului de leptină nu sa modificat de la pasajul 15-35. C și D: celulele STC-1 au fost fixate în paraformaldehidă 4%. Imunomarcarea receptorilor de leptină a fost efectuată cu doi anticorpi policlonali diferiți de iepure: TP 283 (C), care recunoaște toate izoformele Ob-R și OBR 12-A (D), un antiser specific pentru izoforma Ob-Rb. Săgețile indică semnale puternice pe membranele celulare STC-1.